霍如雪++劉振寧++楊青

摘要：果膠甲酯酶屬于碳水化合物酯酶家族CE-8，是調(diào)節(jié)果膠甲酯化程度的一種普遍存在的酶，是植物細胞壁的主要成分。為深入研究桃PME基因家族的功能，利用生物信息學方法對桃基因組中PME基因家族成員進行鑒定，并對其基因組信息、蛋白生理生化特征、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化樹等方面進行了研究。結(jié)果表明：在桃基因組中共鑒定出69個PME基因，可以分為Group Ⅰ、Group Ⅱ兩大類，Group Ⅱ又可以進一步分成3個分支；PME基因在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，并存在明顯的串聯(lián)重復現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)18個串聯(lián)重復基因簇，包含47個基因，串聯(lián)重復是桃PME基因擴增的主要方式。對桃PME基因結(jié)構(gòu)的分析表明，PME基因在進化上存在著一定的保守性；對桃PME蛋白氨基酸序列的多重比對發(fā)現(xiàn)了PME蛋白5個典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域；通過MEME軟件對桃PME蛋白保守基序的分析發(fā)現(xiàn)了12個比較保守的基序。

關(guān)鍵詞：桃；果膠甲酯酶；基因家族；生物信息學

中圖分類號： S662.101文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0024-07

E-mail：wgq@lcu.edu.cn。果膠是植物細胞初生壁和胞間層的主要成分[1]，果膠的去酯化能夠引起植物細胞結(jié)構(gòu)和功能特性的改變，在果實成熟軟化、器官脫落和衰老、花粉發(fā)育、花粉管生長和抗逆性等方面具有重要作用[2-9]。果膠的去酯化是由果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME，EC 3.1.1.11）催化完成的，果膠甲酯酶廣泛存在于所有高等植物以及一些細胞壁降解的微生物如細菌、真菌中[10]。在高等植物中，果膠甲酯酶通常以多種異構(gòu)體的形式存在，表現(xiàn)出對特定細胞類型的特異性[11]。

果膠甲酯酶基因（PMEs）屬于一類比較大的基因家族，在高等植物中，根據(jù)其基因和蛋白的結(jié)構(gòu)特點可以分為2類：Type Ⅰ、Type Ⅱ。Type Ⅱ類PME蛋白具有1個比較長的N-端PRO區(qū)域，而Type Ⅰ類PME蛋白的PRO區(qū)域很短甚至缺失。對PRO區(qū)域功能的研究表明，該區(qū)域具有將PME蛋白定位到細胞壁上、蛋白的正確折疊及對PME活性的抑制等作用[12]。對PME基因功能的研究表明，PME基因參與了形成層細胞的分化[13]、下胚軸的伸長[14]、花粉發(fā)育[7，15]、花粉管生長[5-6]和果實成熟[2，16]等一系列生理生化過程。另外，在食品加工和造紙等生產(chǎn)工藝中已廣泛利用果膠甲酯酶活性來改善產(chǎn)品品質(zhì)[17]。目前已經(jīng)對擬南芥[6]、水稻[18]、楊樹[19]、小立碗蘚[20]等物種中的PME基因進行了全基因組鑒定和分析，而對桃PME基因的研究僅限于對桃果實成熟過程中PME蛋白活性變化[21-22]和PME基因表達量變化[23]的分析，缺乏從全基因組水平上對桃PME基因家族的相關(guān)研究。

桃（Prunus persica）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，是世界上廣泛栽培的落葉果樹之一。與薔薇科木本植物如李、酸櫻桃等多倍體果樹相比，桃是二倍體（n=8 ），具有相對較小的基因組（230 Mbp），而且具有相對短的童期（ 2～3年），這些獨特的優(yōu)點使得桃成為李屬及其他薔薇科植物的模式基因組物種[24]。桃基因組測序的完成和序列釋放[25-26]使得在全基因組水平上對桃重要功能基因的發(fā)掘比較和功能研究成為可能。本研究利用生物信息學方法對桃PME基因家族成員進行鑒定和基因組注釋，并分析了其基因結(jié)構(gòu)和保守域，以期為進一步對桃PME家族基因的功能研究提供基礎(chǔ)信息并最終在分子水平上對桃品種的改良提供明確候選基因。

1材料與方法

1.1桃PME基因家族的鑒定

首先，利用擬南芥PME蛋白的氨基酸序列作為種子序列在桃基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_ version 2.0）[26]中進行BLASTp比對搜索。其次，為保證候選基因沒有被遺漏，我們又利用搜索到的PME蛋白的氨基酸序列對桃基因組數(shù)據(jù)庫進行2次BLASTp比對搜索。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.janelia.org/）[27]、SMART數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[28]、NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） [29]分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)候選蛋白的氨基酸序列是否具有PME的保守結(jié)構(gòu)域進行候選PME基因的篩選和鑒定。

1.2桃PME基因的基因組信息和染色體定位

桃PME基因的序列和基因組信息通過桃基因組數(shù)據(jù)庫獲得，并根據(jù)每個PME基因在染色體上的精確位置和染色體長度使用Photoshop軟件將其人工定位到對應(yīng)染色體上。

1.3桃PME蛋白的生理生化分析

PME蛋白的分子量和等電點通過Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html） [30]來預(yù)測。信號肽序列通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[31]進行分析。糖基化位點通過NetNGly （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）[32]進行預(yù)測。

1.4桃PME基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進化樹分析

利用GSDS網(wǎng)站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[33]來分析PME基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。用在線的MEME軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html） [34]鑒定PME蛋白氨基酸序列中的基序。用Clustal X軟件[35]對PME蛋白的氨基酸序列進行比對。在進化樹的構(gòu)建方面，首先利用MEGA5.0軟件（http：//www.megasoftware.net/）[36]自帶的Clustal W應(yīng)用對蛋白的氨基酸序列進行比對分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴展罰分設(shè)置為0.2。然后利用MEGA5.0軟件將比對好的序列構(gòu)建進化樹，進化樹使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正、成對刪除、1 000次重復等建樹參數(shù)[37]。

2結(jié)果與分析

2.1桃PME基因家族的鑒定與注釋

根據(jù)擬南芥PME蛋白的氨基酸序列，通過對桃基因組數(shù)據(jù)庫的BLASTp比對搜索，在桃基因組中共鑒定出69個PME蛋白（表1）。根據(jù)PME蛋白中有無PME、PMEI結(jié)構(gòu)域可以將這69個PME蛋白分成2大類：Group Ⅰ、Group Ⅱ。利用MEGA 5.0軟件對桃和模式植物擬南芥中PME蛋白進化樹構(gòu)建和聚類分析的研究，又可以將Group Ⅱ細分成Group Ⅱ-a、Group Ⅱ-b、Group Ⅱ-c 3類（圖1）。Group Ⅰ包括32個PME蛋白成員，只具有1個PME結(jié)構(gòu)域；基因的開放閱讀框長度相對較短，長度為501～1 443 bp，編碼166～480位氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量為18.67～51.48 ku，等電點范圍為 4.93～9.42。Group Ⅱ包括37個PME蛋白成員，同時具有PME、PMEI結(jié)構(gòu)域；基因的開放閱讀框長度為477～3 534 bp，編碼158～1 177位氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量為17.26～127.82 ku，等電點為5.54～9.63。對桃PME蛋白信號肽的預(yù)測表明，其中39個PME蛋白存在1段N末端信號肽，信號肽長度范圍在1～16到1～33個氨基酸之間。值得注意的是，Group Ⅱ-b中的12個蛋白成員均沒有預(yù)測到信號肽的存在。前人研究發(fā)現(xiàn)，PME蛋白的糖基化影響其酶活性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性、對果膠的活性等[38-39]。筆者對桃PME蛋白糖基化位點的預(yù)測表明，PME蛋白中廣泛存在著1～14個不等的糖基化位點。2.2桃PME基因的染色體定位分析

為對桃PME基因在染色體上的分布有更加明確的認識，根據(jù)桃PME基因的基因組信息，分別將其定位到桃的8條染色體上，其中Prupe.I005000、Prupe.I005200這2個PME基因位于scaffold_51上而未能正確定位到染色體上（圖2）。結(jié)果表明，PME基因在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第1、2、6、7條染色體上具有較多的PME基因，而第3、4、5、8條染色體上的PME基因比較少。此外，PME基因在染色體上的分布存在明顯的串聯(lián)重復現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)18個串聯(lián)重復的基因簇，共包含47個基因，占PME基因總數(shù)的68.1%。

2.3桃PME基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究桃PME基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)桃基因組信息獲取了每個PME基因的DNA、CDS序列信息并構(gòu)建了其基因結(jié)構(gòu)（圖3）。結(jié)果表明，大部分PME基因都有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。通過對基因結(jié)構(gòu)和基因進化樹的比較分析發(fā)現(xiàn)：每個分支中

2.4桃PME蛋白的氨基酸序列比對和保守域分析

為研究桃PME蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用CLUSTAL X對桃PME蛋白的氨基酸序列進行多重比對。圖4的比對結(jié)果表明，PME蛋白一般具有5個典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域：Region Ⅰ（GxYxE）、Region Ⅱ（QAVAxR）、Region Ⅲ（QDTL）、Region Ⅳ（GxxDFIFG）、Region Ⅴ（YLGRxWx）。另外，利用MEME軟件對桃PME蛋白保守基序的分析發(fā)現(xiàn)了12個比較保守的基序（motif 1～motif 12）（圖5），其中motif 7、motif 6、motif 4、motif 1、motif 2分別對應(yīng)Ⅰ—Ⅴ 5個保守結(jié)構(gòu)域。

3結(jié)論與討論

桃、擬南芥、水稻、楊樹基因組大小分別為230、125、466、480 Mbp，這4個物種基因組中PME基因的數(shù)量分別為69、66、35、89個，說明桃基因組中PME基因出現(xiàn)了一定的數(shù)目擴增。基因擴增是基因組進化最主要的驅(qū)動力之一，是產(chǎn)生具有新功能的基因和進化出新物種的主要原因之一?；蚩梢酝ㄟ^多種方式進行擴增，包括全基因組復制、串連復制、片

段復制和逆轉(zhuǎn)座復制等。對桃PME基因染色體定位的研究發(fā)現(xiàn)，PME基因在染色體上的分布存在明顯的串聯(lián)重復現(xiàn)象，共有18個串聯(lián)重復基因簇，包含47個基因，占PME基因總數(shù)的68.1%，說明串聯(lián)重復是桃PME基因擴增的主要方式。

對桃、擬南芥、楊樹、水稻和小立碗蘚等5個代表性物種中PME基因家族成員分類比較的研究發(fā)現(xiàn)，桃、擬南芥、楊樹、水稻這4個高等植物中均同時具有Group Ⅰ、Group Ⅱ 2類PME基因，但是小立碗蘚中只具有Group Ⅰ類的PME基因。筆者也分析了6種真菌、10種細菌中的PME基因，發(fā)現(xiàn)它們也都屬于Group Ⅰ類，這說明Group Ⅱ類的PME基因是在苔蘚植物、維管植物分化完成后才出現(xiàn)的，這與Markovi等對細菌、真菌和高等植物中PME基因進化樹的分析結(jié)果[10]是一致的。但是關(guān)于PME基因到底是在哪一類物種中首先出現(xiàn)的，還需要進一步研究。

桃的使用主要是鮮食、加工2種方式，而這2種方式對果實的硬度、成熟度要求不同[40-41]。果實的軟化主要是多聚半乳糖醛酸酶（PG）、PME相互作用的結(jié)果。目前一般認為，PME的作用是去除果膠分子鏈上半乳糖醛酸羧基上的酯化基團（主要是羥甲基或羥乙基），增加果膠在水中的溶解度，從而造成適于PG作用的條件[42]。Tieman等應(yīng)用反義RNA技術(shù)在番茄中高表達反義PME mRNA，抑制了果實中果膠甲酯酶的活性，其成熟過程雖然沒有受到明顯干擾，但是果膠的高度甲酯化明顯影響了果膠代謝，改善了果實品質(zhì)[43]。另外，果膠甲酯酶在果汁生產(chǎn)中廣泛用于澄清果汁、提高果漿出汁率、浸提和液化果肉組織以及用于生產(chǎn)混濁果汁及帶果肉的果汁等[44]，具有重要的食品加工價值。因而對桃PME基因的研究能夠為培育符合市場需求的桃優(yōu)良品種、應(yīng)用基因工程改良果實成熟特性以及桃加工方式的創(chuàng)新等提供重要的理論依據(jù)，具有現(xiàn)實的指導意義。

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