翁艷英，張貞發(fā)，曾振芳，蘇秀芳

(廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程系 廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西 崇左 532200 )

減壓內(nèi)部沸騰法提取人面子樹皮總黃酮的研究

翁艷英，張貞發(fā)，曾振芳，蘇秀芳

(廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程系 廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西 崇左 532200 )

為優(yōu)化人面子樹皮中總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取工藝，提高總黃酮的提取率，采用單因素試驗(yàn)的方法，考察解吸及提取過程中的解吸劑體積分?jǐn)?shù)、解吸時(shí)間、提取劑體積分?jǐn)?shù)、提取劑用量、提取溫度及提取時(shí)間等6個(gè)因素對提取效果的影響。結(jié)果表明，提取過程中提取劑體積分?jǐn)?shù)影響效果最顯著，其次是提取時(shí)間和提取溫度，影響最小的是提取劑用量。最佳提取條件：取2.00 g人面子樹皮粉末，先用4 mL 40%乙醇解吸20 min，然后用100 mL 40%乙醇在50 ℃和0.03 MPa的條件下提取2次，每次6 min。在該提取條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，人面子樹皮總黃酮提取率為41.51%。與傳統(tǒng)回流提取法相比，提取時(shí)間縮短了68 min，提取率提高了9.05個(gè)百分點(diǎn)。說明低溫快速的減壓內(nèi)部沸騰法對人面子樹皮總黃酮的提取效果良好。

人面子； 總黃酮； 減壓內(nèi)部沸騰法； 正交試驗(yàn)

近年來，黃酮類化合物因具有較強(qiáng)的生物活性，越來越受到學(xué)者的關(guān)注，其藥效表現(xiàn)在腫瘤、心血管疾病的治療、抗菌、抗氧化活性等方面[1-2]。植物中總黃酮的提取方法主要集中在乙醇回流提取[3]、超聲波提取[4]、微波提取[5-6]、超聲酶法提取[7]等，其提取時(shí)間相對較長，提取溫度較高，提取液中雜質(zhì)多，而且微波和超聲波提取要求設(shè)備費(fèi)用較高。減壓內(nèi)部沸騰法，主要是在減壓條件下低溫提取，發(fā)生的內(nèi)部沸騰提取強(qiáng)化了提取過程[8]。該法已經(jīng)成功應(yīng)用到多種植物黃酮[9-12]和其他成分的提取[13-16]，均取得了較好的提取效果。與傳統(tǒng)水提或醇提相比，該法提取液中雜質(zhì)少，提取溫度低，有利于有效成分的后續(xù)分離純化。

人面子系漆樹科人面子屬植物，又名人面樹，為常綠大喬木，分布于廣東、海南、廣西、云南等，屬于桂西南地帶特有的植物，其葉、果實(shí)、果核、根及皮均可藥用[17]。 黃酮類化合物是人面子的主要有效成分之一，目前對人面子總黃酮的提取研究報(bào)道較少[18]。桂西南地區(qū)人面子資源豐富，為了更好地發(fā)揮人面子藥效并有效利用地方豐富植物資源，以崇左人面子樹皮為原料，采用減壓內(nèi)部沸騰法提取人面子總黃酮，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，為人面子的后續(xù)開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

人面子樹皮干燥品采自廣西崇左市。試劑：蘆丁對照品購于上海金穗生物科技有限公司；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、乙醇均為分析純，購于廣東汕頭市西隴化工廠。儀器：分光光度計(jì)、精密恒溫浴槽、減壓提取裝置等。

1.2 方法

1.2.1 人面子樹皮總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取 將2.00 g的人面子樹皮粉末置于50 mL燒杯中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸劑潤濕一段時(shí)間，使解吸劑充分滲透樹皮的細(xì)胞組織，總黃酮從吸附狀態(tài)中溶解下來；然后加入一定量的某體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取劑，于精密恒溫槽中迅速減壓至內(nèi)部產(chǎn)生沸騰(物料表面產(chǎn)生小氣泡)，提取一段時(shí)間，抽濾，濾渣進(jìn)行第2次提取，提取方法與第1次提取相同，合并濾液，顯色法分析樣品，計(jì)算總黃酮提取率。

1.2.2 人面子樹皮總黃酮的檢測 取1.00 mL減壓內(nèi)部沸騰提取液稀釋10倍，再取1.00 mL于25 mL比色管中，加入30%乙醇定容至12.5 mL，加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻后放置5 min，然后加入0.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min，接著加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，混勻，30%乙醇定容至刻度，采用試劑空白作參比，在510 nm的波長下測定其吸光度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別準(zhǔn)確量取0 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL、12.00 mL質(zhì)量濃度為1.018 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的比色管中，按照分析步驟進(jìn)行顯色分析，測定吸光度，以吸光度和蘆丁含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為A=0.486 4m+0.009 6，其中A為吸光度，m為蘆丁含量(mg)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，在 0～1.221 6 g/L內(nèi)有較好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮提取率，計(jì)算公式如式(1)所示：

提取率=m×n1 000×M×100%

(1)

其中：M—所稱取的人面子樹皮質(zhì)量(g)；m—回歸方程求得的總黃酮含量(mg)；n—稀釋倍數(shù)。

1.2.4 減壓內(nèi)部沸騰法提取總黃酮的單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 解吸劑體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g人面子樹皮粉末各6份，在水浴恒溫50 ℃、提取壓力為0.03 MPa條件下，分別用體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇4 mL解吸25 min，然后用100 mL 40%乙醇提取8 min，考察解吸過程乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 解吸時(shí)間對提取率的影響 設(shè)置解吸時(shí)間分別為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，固定其他條件及乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，考察解吸時(shí)間對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 提取劑體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響 設(shè)置提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%，解吸20 min，固定其他條件，考察提取過程乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對提取率的影響 設(shè)置提取時(shí)間分別為2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，固定其他條件及提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，考察提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.5 提取劑用量對提取率的影響 設(shè)置提取劑乙醇用量分別為40 mL、60 mL、80 mL、100 mL、120 mL，固定其他條件及每次提取時(shí)間為6 min，考察提取劑用量對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.6 提取溫度對提取率的影響 設(shè)置提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，固定其他條件及每次提取劑用量為100 mL，考察提取溫度對總黃酮提取率的影響。

1.2.5 減壓內(nèi)部沸騰法提取總黃酮的的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定人面子樹皮質(zhì)量為2.00 g，解吸劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，用量為4 mL，在壓力0.03 MPa下進(jìn)行提取試驗(yàn)，選擇提取時(shí)間、提取溫度、提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量4個(gè)提取因素作為正交試驗(yàn)的考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 減壓內(nèi)部沸騰法提取總黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 解吸劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響 從圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，人面子樹皮總黃酮提取率先增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)最大，為27.84%，隨后又逐漸下降，說明樣品已被充分解吸，樣品內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，可能溶出其他雜質(zhì)，影響總黃酮提取。因此，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖1 解吸劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

2.1.2 解吸時(shí)間對提取率的影響 從圖2可以看出，人面子樹皮中的總黃酮提取率隨著解吸時(shí)間的增加而增加，當(dāng)解吸時(shí)間為20 min時(shí)，提取率最高，為29.07%。當(dāng)解吸時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，提取率下降。這可能是解吸時(shí)間為20 min時(shí)樣品已被完全解吸。由于物料的解吸已達(dá)充分，再增加解吸時(shí)間，提取出來的雜質(zhì)更多，影響總黃酮提取效果。因此，選定解吸時(shí)間為20 min。

2.1.3 提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響 從圖3可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，人面子樹皮中總黃酮的提取率先增大后減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)提取率最高。

圖2 解吸時(shí)間對總黃酮提取率的影響

圖3 提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對提取率的影響 由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，人面子樹皮中的總黃酮提取率也增大，當(dāng)提取時(shí)間為6 min時(shí)提取率最大，隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，其他糖類、脂類、色素等雜質(zhì)也會(huì)被提取出來，造成總黃酮提取率下降。

圖4 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響

2.1.5 提取劑乙醇用量對提取率的影響 由圖5可知， 當(dāng)乙醇用量在40～100 mL， 總黃酮提取率隨著提取劑用量的增加而增大，當(dāng)用量超過100 mL后提取率開始下降而且幅度比較大，原因是提取劑用量在100 mL時(shí)大部分樣品已被溶解完。

圖5 提取劑乙醇用量對總黃酮提取率的影響

2.1.6 提取溫度對提取率的影響 由圖6可知，低溫不利于人面子樹皮物料內(nèi)部沸騰，總黃酮提取率不高；溫度升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)激烈，引起滲透、擴(kuò)散加強(qiáng)，人面子樹皮物料內(nèi)部得到充分沸騰，在溫度為50 ℃時(shí)提取率最高，繼續(xù)升高溫度，不僅溶劑沸騰激烈，還可能造成黃酮結(jié)構(gòu)被破壞、雜質(zhì)滲出等情況。

圖6 提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.2 減壓內(nèi)部沸騰法提取總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，人面子樹皮總黃酮提取率的影響因素大小依次是C>A>B>D,即提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫度>乙醇用量。乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響人面子樹皮總黃酮提取率的主要因素，其次是提取時(shí)間。提取人面子樹皮總黃酮最佳的試驗(yàn)組合為A2B2C2D2，即提取溫度50 ℃、提取時(shí)間6 min、提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、乙醇用量100 mL。

表2 減壓內(nèi)部沸騰法提取總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 最佳提取工藝重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

為了考察減壓內(nèi)部沸騰法提取人面子樹皮總黃酮最佳工藝的重復(fù)性，在最佳提取條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別稱取2.00 g的人面子樹皮，加入4 mL 40%的乙醇溶液解吸20 min，在50 ℃的恒溫條件下加入100 mL 40%乙醇溶液，0.03 MPa下減壓提取2次，每次6 min，合并提取液，結(jié)果顯示，總黃酮提取率分別為41.96%、42.45%和40.12%，平均值達(dá)到41.51%。試驗(yàn)結(jié)果充分驗(yàn)證了正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳提取工藝的重現(xiàn)性及合理性。

2.4 減壓內(nèi)部沸騰法與傳統(tǒng)回流法的比較

準(zhǔn)確稱取2.00 g人面子樹皮粉末3份，用100 mL 40%乙醇回流提取2次，每次60 min，測定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見表3。由表3可知，減壓內(nèi)部沸騰法的提取時(shí)間短，比回流提取法縮短68 min，總黃酮提取率提高了9.05個(gè)百分點(diǎn)，說明減壓內(nèi)部沸騰提取法促進(jìn)了人面子樹皮總黃酮的提取，效果良好。

表3 減壓內(nèi)部沸騰法與傳統(tǒng)回流法的比較

3 小結(jié)

本研究以桂西南特有植物人面子的樹皮為原料，以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取劑，采用減壓內(nèi)部沸騰法對總黃酮進(jìn)行提取，確定減壓內(nèi)部沸騰法提取人面子樹皮總黃酮的最佳條件為：取2.00 g人面子樹皮粉末,先用4 mL 40%乙醇解吸20 min，然后加入100 mL 40%乙醇，在50 ℃、0.03 MPa條件下提取2次，每次6 min。該條件下人面子樹皮總黃酮的提取率達(dá)41.51%。與傳統(tǒng)回流法相比，減壓內(nèi)部沸騰法提取人面子樹皮總黃酮的溫度低，提取時(shí)間縮短了68 min，總黃酮提取率提高了9.05個(gè)百分點(diǎn)，說明采用減壓內(nèi)部沸騰法提取人面子樹皮總黃酮是可行的，這為進(jìn)一步進(jìn)行人面子總黃酮的分離純化及生物活性研究奠定基礎(chǔ)。

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Extraction of Total Flavonoids from Dracontomelon duperreanum by Decompressing Inner Ebullition

WENG Yanying,ZHANG Zhenfa,ZENG Zhenfang,SU Xiufang

(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory Breeding Base of Chemistry of Guangxi Southwest Plant Resources, Department of Chemistry and Biology Engineering,Guangxi Normal University for Nationalities,Chongzuo 532200,China)

In order to improve the yield and optimize the extraction technology of the total flavonoids in bark ofDracontomelonduperreanumby decompressing inner ebullition,single factor experiments were conducted to investigate the effects of six factors on the extraction，including the concentration of desorption agent，desorption time，the concentration and the amount of extractant，extraction temperature and time.The results showed that the concentration of extracting agent was the key factor that affected the yield,the effects of extraction time and temperature were secondary and the amount of extraction agent was the least factor.Finally,by the analysis of data,it was found that when 2.00 g of the bark ofDracontomelonduperreanumwere desorbed for 20 minutes using 4 mL 40% ethanol and then extracted twice(6 min/time) in 100 mL 40% ethanol under 50 ℃ and 0.03 MPa,the maximum yield of total flavonoids of 41.51% was obtained.Compared with the traditional ethanol extraction,the decompressing inner ebullition extraction had the following obvious advantages that extraction time was reduced by 68 min,while the yield of total flavonoids increased by 9.05 percentage points.The study proves that the decompressing inner ebullition extraction has such characteristics as low-temperature and speediness in the extraction of total flavonoids from bark ofDracontomelonduperreanum.

Dracontomelonduperreanum; total flavonoids; decompressing innner ebullition; orthogonal test

2015-12-26

2015年廣西教育廳科研項(xiàng)目(KY2015LX540); 廣西教育廳高?？蒲匈Y助項(xiàng)目(YB2014416)

翁艷英(1985-)，女，廣西欽州人，講師，主要從事天然產(chǎn)物提取純化研究及教學(xué)工作。 E-mail:1289892514@qq.com

S792.99

A

1004-3268(2016)07-0148-05