李珊珊，李東華，呂福琨，董 晶，李艷青，杜炳旺

(廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)系，廣東 湛江524088)

慢羽系麒麟公雞純合個(gè)體分子檢測(cè)方法的建立

李珊珊，李東華，呂福琨，董 晶，李艷青，杜炳旺*

(廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)系，廣東 湛江524088)

為建立一種快速準(zhǔn)確鑒定麒麟公雞慢羽純合子的分子檢測(cè)方法，以加快純合慢羽系及其配套系的育種速度，利用雞性連鎖羽速基因K/k中慢羽基因K與禽白血病內(nèi)源性病毒基因ev21的緊密連鎖關(guān)系，選擇241只(直觀鑒定171只為表型慢羽，70只為表型快羽)140日齡麒麟公雞，應(yīng)用PCR擴(kuò)增URa和URb基因以鑒定其快、慢羽型，再擴(kuò)增ev21基因，并采用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ對(duì)慢羽雞擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，檢測(cè)基因型為純合子的慢羽公雞。麒麟雞羽速類(lèi)型檢測(cè)結(jié)果顯示，慢羽公雞(170只)2條帶，快羽麒麟公雞(71只)1條帶。慢羽公雞酶切基因分型結(jié)果顯示，酶切后有2條帶的為ev21缺失個(gè)體(72只)，有3條帶的是雜合個(gè)體(94只)，有1條帶的為純合個(gè)體(5只)。綜上，可以利用ev21插入位點(diǎn)鑒定麒麟雞基因型是否為純合的慢羽個(gè)體。

麒麟雞； 羽速基因；ev21基因； 純合子； 配套系

麒麟雞又稱卷毛雞或卷羽雞，是廣東省茂名市信宜、高州一帶的特色優(yōu)質(zhì)土雞[1]。由于該雞攜帶不完全顯性遺傳的卷羽基因F，使其羽鉤不能與相鄰的羽小枝的背緣相勾連，導(dǎo)致該雞羽毛向外彎曲形成卷羽。該雞全身羽毛翻卷使得部分皮膚裸露而散熱性能良好，適宜在南方熱帶地區(qū)飼養(yǎng)。為了更好地利用該品種雞耐高溫的特性，育種工作者擬培育出可自別雌雄的快慢羽配套系。常規(guī)的傳統(tǒng)育種技術(shù)，需要培育純合慢羽系種雞，對(duì)表型慢羽的公雞通過(guò)測(cè)交試驗(yàn)確定基因型為純合的慢羽公雞，費(fèi)力耗時(shí)，影響育種速度。為此，急需建立一種快速準(zhǔn)確鑒別純合慢羽麒麟雞的分子檢測(cè)方法，以鑒定表型慢羽公雞是否純合，進(jìn)而盡快建立基因型為純合的慢羽系，加快麒麟雞快慢羽自別雌雄配套系的育種速度。

前人研究發(fā)現(xiàn)，影響雞羽毛生長(zhǎng)快慢的基因是性別基因[2]，野生型快羽基因k為隱性基因，而顯性基因K則延緩雛雞主翼羽的生長(zhǎng)造成慢羽表型。Warren[3]研究發(fā)現(xiàn)，雞的尾羽生長(zhǎng)也受到性別基因控制；Bacon等[4]發(fā)現(xiàn)，位于慢羽雞Z染色體的顯性基因K與ev21插入片段性連鎖遺傳，且認(rèn)為鑒定公雞慢羽表型的主要依據(jù)是慢羽基因K與ev21緊密的連鎖關(guān)系；Siegel等[5]進(jìn)一步對(duì)慢羽表型的顯性基因K與ev21的性連鎖關(guān)系進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，慢羽基因K同時(shí)可以造成純合子和雜合子的表型差異，由此可以利用性連鎖遺傳基因ev21對(duì)慢羽雞進(jìn)行純合子和雜合子的鑒別。Smith 等[6]根據(jù)慢羽雞性染色體Z上的ev21和顯性基因K的緊密關(guān)系，又劃分了3個(gè)區(qū)域，ev21整合部位OR、通過(guò)復(fù)制產(chǎn)生同源DNA區(qū)域的ev21未占據(jù)重復(fù)片段URa、相對(duì)應(yīng)存在于快羽雞中非整合DNA區(qū)域的未占據(jù)重復(fù)片段URb，因URb含有酶切位點(diǎn)能被限制性內(nèi)切酶HaeⅢ切開(kāi)，但URa沒(méi)有酶切位點(diǎn)而不能被酶切，因此，可以通過(guò)PCR擴(kuò)增ev21基因、酶切區(qū)分URa和URb。由于雜合的慢羽公雞同時(shí)擁有等位基因URa和URb，且Z染色體上(URa)還含有插入片段ev21，因此，也可以通過(guò)酶切區(qū)別雜合子、純合子。鑒于此，以表型慢羽麒麟公雞為研究對(duì)象，對(duì)位于Z染色體上性連鎖遺傳基因ev21進(jìn)行分子檢測(cè)，鑒定出慢羽公雞個(gè)體，利用酶切位點(diǎn)對(duì)慢羽公雞進(jìn)行基因分型，挑出純合個(gè)體，剔除雜合子和ev21缺失個(gè)體，從而加快慢羽純系的建立，為今后的選優(yōu)提純、配套雜交及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物

試驗(yàn)麒麟公雞表型快、慢羽基礎(chǔ)群種雞由廣東海洋大學(xué)家禽育種中心提供。

1.2 麒麟雞羽速類(lèi)型檢測(cè)

對(duì)1日齡雛雞進(jìn)行表型快羽和表型慢羽觀察和分群，凡主翼羽長(zhǎng)于覆主翼羽的，判定其為快羽雞，凡主翼羽短于或等于覆主翼羽，判定為慢羽雞。當(dāng)該批供試雞長(zhǎng)至140日齡時(shí)正式進(jìn)入試驗(yàn)階段。

140日齡時(shí)，對(duì)直觀鑒定表型為慢羽的171只公雞和表型為快羽的70只公雞進(jìn)行翅靜脈采血。參考文獻(xiàn)[7-8]的引物序列， PCR擴(kuò)增URa(396 bp)和URb(341 bp)的片段，檢測(cè)出羽速類(lèi)型。

1.3ev21基因插入位點(diǎn)檢測(cè)

用DNA試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA。參考韓瑾潤(rùn)[7]的研究，擴(kuò)增體系：水16.8 μL，10× PCR Buffer 2.5 μL,dNTP Mix 2 μL，TaqDNA polymerase 1 μL,引物up、in、down分別為0.3 μL、0.3 μL、0.6 μL，模板1.5 μL，共25 μL的體系。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。引物信息見(jiàn)表1。

表1 麒麟雞快慢羽和純合個(gè)體檢測(cè)引物信息

1.4 慢羽麒麟公雞基因型檢測(cè)

參考Iraqi等[8]設(shè)計(jì)的引物和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系：引物F和R(表1)分別為0.2 μL，雙蒸水8.1 μL，模板1 μL，2×TaqPCR Mix 10.5 μL。取10 μL PCR產(chǎn)物，加入0.8 μL限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、1.2 μL 10×Buffer、8 μL雙蒸水，酶切體系過(guò)夜消化(7～12 h)。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物。

1.5 酶切產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證

為了更進(jìn)一步證明使用酶切手段分型的慢羽系純合麒麟公雞個(gè)體是否正確，又分別將慢羽麒麟公雞純合子、雜合子、ev21缺失個(gè)體的酶切產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，從而根據(jù)酶切位點(diǎn)驗(yàn)證基因型為純合子的慢羽雞個(gè)體。

2 結(jié)果與分析

2.1 麒麟雞羽速類(lèi)型的分子鑒定結(jié)果

對(duì)直觀鑒定的241份麒麟雞進(jìn)行分子鑒定，表型鑒定171只慢羽公雞，分子檢測(cè)結(jié)果為170只慢羽公雞，1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)到2條帶型，片段大小分別為396 bp和341 bp；表型鑒定70只快羽公雞，分子檢測(cè)結(jié)果為71只快羽型麒麟雞，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，只有1條帶型且片段大小為396 bp(圖1)。

M.DL1000 Marker; 1、2、3、6、7、8、9、10.慢羽型; 4、5.快羽型

2.2 慢羽公雞分型檢測(cè)結(jié)果

對(duì)171只慢羽公雞進(jìn)行酶切分型，結(jié)果顯示，5個(gè)純合個(gè)體，94個(gè)雜合個(gè)體，72個(gè)ev21缺失個(gè)體。酶切結(jié)果出現(xiàn)3條帶為雜合子(分別為1 450 bp、1 068 bp和382 bp)，只有1條帶(1 450 bp)為純合子，有2條帶為ev21缺失個(gè)體(1 068 bp和382 bp)(圖2)。

M.DL2000 Marker； 1.純合個(gè)體； 2、3、4、5、7.ev21缺失個(gè)體； 6、8.雜合個(gè)體

2.3 慢羽公雞分型測(cè)序結(jié)果

將部分酶切基因分型為純合個(gè)體、ev21缺失個(gè)體、雜合個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(圖3)，可以清楚地看到ks1(ev21缺失個(gè)體)和ks2(雜合個(gè)體)的350—355 bp存在GTGGCC片段，其中GGCC為酶切位點(diǎn)， ks3(純合個(gè)體)在該酶切位點(diǎn)由于突變成GGCT而不能被酶切，并且在中間還插入了8個(gè)堿基TAACTAAG的片段，所以純合個(gè)體突變成GGCTAACTAACTAAG。雜合個(gè)體的測(cè)序峰圖從酶切位點(diǎn)以后出現(xiàn)疊加現(xiàn)象，而純合個(gè)體和ev21缺失的峰圖單一，證明測(cè)序結(jié)果與酶切結(jié)果相符(圖4)。

深色表示序列相同； 淺色代表兩者相同序列；…代表ks1(ev21缺失個(gè)體)和ks2(雜合個(gè)體)缺失序列

圖4 麒麟雞慢羽公雞酶切測(cè)序分析

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)241只麒麟公雞進(jìn)行快慢羽分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表型鑒定的171只慢羽公雞和70只快羽公雞，分子檢測(cè)屬慢羽公雞個(gè)體有170只，快羽公雞個(gè)體71只，僅有1只表型鑒定為慢羽，而分子鑒定結(jié)果為快羽。說(shuō)明本研究中的分子檢測(cè)方法可用于麒麟公雞的選育，且有很高的準(zhǔn)確性。

在家禽育種公司建立快慢羽自別雌雄配套系僅僅通過(guò)選擇慢羽的表型性狀是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，往往不能完全排除慢羽系公雞中的雜合個(gè)體。因此，急需尋找一種鑒定純合子的分子手段。由于快羽公雞的性染色體基因型是ZkZk，因而快羽公雞的表型能直觀反映基因型，這也就表明快羽公雞是純合個(gè)體。但是，慢羽公雞的性染色體基因型有ZKZK和ZKZk，因而從表型并不能看出其為純合個(gè)體或雜合個(gè)體。因此，要想獲得純合的慢羽系公雞，研究慢羽形成的分子生物學(xué)機(jī)制極其重要。影響慢羽形成機(jī)制的因素較多，有學(xué)者研究表明，雞Z染色體上慢羽基因位點(diǎn)大致在9 607 480—10 607 757 bp處，且9 966 364—10 142 688 bp基因組的復(fù)制導(dǎo)致了慢羽表型[9]。可推斷快慢羽表型的形成是由于羽速基因型之間的差異表達(dá)引起的。Luo等[10]研究結(jié)果顯示，影響羽毛生長(zhǎng)的毛囊角蛋白對(duì)慢羽的形成起著關(guān)鍵性的作用，發(fā)現(xiàn)慢羽雛雞的翼羽皮膚細(xì)胞中有許多特殊羽毛角蛋白過(guò)表達(dá)，這可能是造成慢羽表型的又一重要原因。但Kansaku等[11]根據(jù)系譜測(cè)驗(yàn)估計(jì)顯性基因K與ev21的連鎖距離不超過(guò)0.3 cM，并且還推斷顯性基因K與ev21緊密的連鎖距離可能是鑒定慢羽基因K的主要依據(jù)。此外，Siegel等[5]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)與慢羽顯性基因K性連鎖遺傳的ev21基因可以分型出慢羽系公雞純合和雜合子；李競(jìng)一等[12]利用性連鎖遺傳基因ev21對(duì)商品代慢羽公雞進(jìn)行檢測(cè)，剔除ev21缺失個(gè)體；李培周等[13]利用與伴性基因性連鎖遺傳的ev21片段結(jié)構(gòu)對(duì)清遠(yuǎn)麻雞、貴妃雞進(jìn)行基因分型，剔除ev21缺失個(gè)體；Elferink等[9]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也檢測(cè)出了慢羽公雞的純合個(gè)體。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)部分慢羽麒麟公雞純合子和雜合子進(jìn)行多序列比對(duì)分析，可以很明顯地看到URa和URb在序列上的差異性，并且找到限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。171只慢羽麒麟公雞中，PCR擴(kuò)增后酶切結(jié)果為1條帶的有5個(gè)個(gè)體，即為純合子，基因型為ZKZK，測(cè)序峰圖沒(méi)有GGCC酶切位點(diǎn)，說(shuō)明只擴(kuò)增出URa；72個(gè)個(gè)體酶切結(jié)果有2條帶，在理論的酶切位點(diǎn)處有GGCC酶切位點(diǎn)，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物只擴(kuò)增出URb，并未擴(kuò)增出URa，位于URa內(nèi)部的ev21結(jié)合位點(diǎn)不存在于這些個(gè)體基因組中，即為ev21缺失個(gè)體；94個(gè)個(gè)體酶切結(jié)果為3條帶，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物中，URa和URb均被擴(kuò)增出，URb被內(nèi)切酶HaeⅢ切為2條帶，即為雜合子，這與測(cè)序峰圖出現(xiàn)疊加相符。

本試驗(yàn)通過(guò)位于Z染色體上慢羽顯性基因K與性連鎖遺傳基因ev21的緊密關(guān)系，剔除慢羽系麒麟公雞中雜合子和ev21缺失個(gè)體，分型出純合個(gè)體，為建立一種快速且準(zhǔn)確鑒別麒麟公雞慢羽系純合子的分子檢測(cè)方法提供了理論依據(jù)。

[1] 杜炳旺,陶林,汪忠艷,等．麒麟雞(卷羽雞)種質(zhì)特性研究初報(bào)[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家禽學(xué)分會(huì)第九次代表會(huì)議暨第十六次全國(guó)家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.揚(yáng)州:[出版者不詳],2013:44-47.

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Establishment of Molecular Identification Techniques for Frizzle Chicken Early Feathering and Late Feathering

LI Shanshan,LI Donghua,Lü Fukun,DONG Jing,LI Yanqing,DU Bingwang*

(Department of Animal Science,Guangdong Ocean Univerisity,Zhanjiang 524088,China)

In order to establish a rapid and accurate molecular identification techniques for the frizzle chicken early feathering and late feathering to speed up the formation of complete set line,male Kirin chickens of 241 at 140 days were selected(171 late-feathering phenotypic,70 eaily-feathering phenotypic).The slight distance relation of late-feathering geneKin linkage with feathering geneK/kof chicken and endogenousev21 was used, to discriminate the eaily-feathering and late-feathering cock using PCR amplification ofev21 gene and to detect homozygote of genotype late-feathering cock through the amplified products digestion using the restriction enzyme(HaeⅢ).The results showed that eaily-feathering frizzles had a band(71),late-feathering had two bands(170).Compared with eye identification, the agreement rate was 99.41%.TheHaeⅢ cleaved genotyping results of late-feathering cock showed that the chicken missingev21 had two bands(72),the individuals with three bands were heterozygous(94),and homozygous individuals had a band(5).Therefore,ev21 insertion site could be used for identifying genotype homozygous Kirin male chicken.

Kirin chicken; feathering gene;ev21 gene; homozygote; complete set line

2016-01-16

廣東省創(chuàng)新強(qiáng)校重大項(xiàng)目(GDOU2013050222)

李珊珊(1990-)，女，河南鄭州人，在讀碩士研究生，研究方向：優(yōu)質(zhì)雞育種。E-mail：1207033094@qq.com

*通訊作者：杜炳旺(1954-)，男，山西運(yùn)城人，教授，主要從事優(yōu)質(zhì)雞遺傳育種工作。E-mail：dudu903@163.com

S831

A

1004-3268(2016)07-0118-04