王斌 邢體坤 宋路萍 楊振蘋 荊新蕊 王亞萍 黃帥 張靜靜

[摘要]目的 探討環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在目標(biāo)質(zhì)粒單堿基突變，酶切位點(diǎn)修改和片段刪除中的應(yīng)用。方法 設(shè)計(jì)包含目標(biāo)突變，部分互補(bǔ)且5端含有5～8 bp突出的引物對(duì)，環(huán)狀質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，甲基化酶DpnI酶消化去除模板質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)進(jìn)行缺口修復(fù)，獲得定點(diǎn)突變的目標(biāo)質(zhì)粒。結(jié)果 通過酶切和基因測(cè)序證明，環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)可高效用于單堿基突變、酶切位點(diǎn)修改和片段刪除等突變。結(jié)論 環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)能夠簡(jiǎn)便、高效、快捷地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)質(zhì)粒的單堿基突變、酶切位點(diǎn)修改和片段刪除，基本滿足藥物開發(fā)過程中載體構(gòu)建的需求。

[關(guān)鍵詞]環(huán)狀定點(diǎn)誘變;片段刪除;酶切位點(diǎn);PCR擴(kuò)增

[中圖分類號(hào)] R450? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）9（b）-0032-04

Application of circular site-directed mutagenesis in vector construction

WANG Bin1? ?XING Ti-kun2? ?SONG Lu-ping2? ?YANG Zhen-ping2? ?JING Xin-rui2? ?WANG Ya-ping2? ?HUANG Shuai2? ?ZHANG Jing-jing2

1. Department of Quality Control， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.， He′nan Province， Xinxiang? ?453000， China; 2. Department of Recombinant Cell， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.， He′nan Province， Xinxiang? ?453000， China

[Abstract] Objective To explore the application of circular site-directed mutagenesis technology in single base mutation， restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid. Methods The primer pairs were designed including target mutation， partial complementation， and 5 end contains 5-8 bp protruding. The circular plasmid was used as template for amplification and digested and removed by methylase enzyme DpnI. Transform DH5α for gap repair then site-directed mutation plasmid was obtained. Results Through the validation by enzyme cutting and gene sequencing， circular site-directed mutagenesis technology could be efficiently used in single base mutation， modification of enzyme site and deletion of fragment. Conclusion The circular site-directed mutagenesis technology is simple， efficient and quick to realize single base mutation， restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid， which can basically meet the needs of molecular construction in the process of drug development.

[Key words] Circular site-directed mutagenesis technology; Fragment deletion; Restriction enzyme cutting site; PCR amplification

定點(diǎn)誘變是體外特異性地取代、插入或缺失DNA序列任何一個(gè)特定堿基的技術(shù)[1]。近幾年來定點(diǎn)誘變技術(shù)發(fā)展迅速，不僅用于基因和蛋白功能的基礎(chǔ)研究，還用于反向遺傳學(xué)改造，主要方法包括重疊PCR法、長(zhǎng)引物PCR法、環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)和酶介導(dǎo)的誘變等技術(shù)[2-7]。重疊PCR法、長(zhǎng)引物PCR法和酶介導(dǎo)的誘變技術(shù)操作復(fù)雜，費(fèi)事費(fèi)力;環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)操作簡(jiǎn)單，誘變效率高，倍受廣大研究者青睞[5-7]。該技術(shù)利用PCR擴(kuò)增引入目標(biāo)突變，經(jīng)甲基化酶DpnI消化原始質(zhì)粒，宿主內(nèi)進(jìn)行修復(fù)和環(huán)化，高效產(chǎn)生目標(biāo)質(zhì)粒[6-7]。藥物開發(fā)為提高藥物的生物學(xué)活性、半衰期、特異性和安全性，對(duì)藥物分子進(jìn)行定向改造不可避免[8-10]。環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在單堿基突變中的應(yīng)用廣泛，本研究探討該技術(shù)在酶切位點(diǎn)插入、替換和刪除基因片段等突變類型中的應(yīng)用，為生物藥物研發(fā)過程中的載體構(gòu)建提供方法學(xué)基礎(chǔ)。近幾年來，隨著基因編輯和基因療法的興起[11-12]，環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在前期核酸改造中也發(fā)揮著不可或缺的作用。本研究旨在探討環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在目標(biāo)質(zhì)粒單堿基突變，酶切位點(diǎn)修改和片段刪除中的應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1供試品

pUC57-7NB2AA質(zhì)粒（金斯瑞生物科技有限公司;訂單編號(hào)：C8100EI120）;pET26b-7NB2AA（華蘭生物自我構(gòu)建保存原核表達(dá)質(zhì)粒）。

1.2材料

B528413型DH5α大腸感受態(tài)和A505255型瓊脂粉（生工生物工程股份有限公司）;LP0042型蛋白胨（賽默飛世爾科技公司）;212750型酵母粉（Becton Dickinson公司）;1161B型NdeI、1010B型BamHI、1160B型NcoI、1094A型Xho I和1235A型DpnI內(nèi)切酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）;AP211型EasyPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;K0502型Gene JET Plasmid Miniprep Kit（賽默飛世爾科技公司）。

1.3儀器設(shè)備

HYG-A型全恒溫?fù)u瓶柜（太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）;1-15PK型臺(tái)式離心機(jī)（賽多利斯公司）;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;S100型PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（BIO-RAD公司）;WD-9403C型紫外儀、DYY-10C型電泳儀和DYCP-31DN型電泳槽（北京六一生物科技有限公司）;Alpha Imager HP型凝膠成像系統(tǒng)（Protein Simple公司）;Nano Drop ONE型微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）。

1.4定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)流程

1.4.1引物設(shè)計(jì)原則

引物包含預(yù)期突變序列且位于互補(bǔ)區(qū)域中間，突變兩側(cè)至少10 bp，引物5端含有5～8 bp突出堿基（圖1）。

1.4.2定點(diǎn)誘變

以環(huán)狀質(zhì)粒作為模板PCR擴(kuò)增，甲基化酶DpnI酶消化1 h，取消化產(chǎn)物5 μl轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，涂板過夜培養(yǎng)，挑單克隆培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、鑒定目標(biāo)克隆。

1.4.2.1 PCR擴(kuò)增? 按照擬突變質(zhì)粒1 μl，引物F（10 μM）1 μl，引物R（10 μM）1 μl，dNTP（2.5 mM）4 μl，Easypfu Buffer 5 μl，Easypfu Buffer 1 μl，補(bǔ)水至50 μl的反應(yīng)體系;94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，（Tm-5）℃退火30 s，72℃延伸（擴(kuò)增長(zhǎng)度/500）10 min，4℃最后保溫反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后即可用于轉(zhuǎn)化。

1.4.2.2 DpnI消化原始質(zhì)粒? 擴(kuò)增PCR產(chǎn)物需要經(jīng)過DpnI甲基化酶去除擬突變質(zhì)粒，反應(yīng)體系為DpnI 1 μl，T Buffer 5 μl，PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μl，補(bǔ)水至50 μl;反應(yīng)條件為37℃孵育1 h。甲基化酶消化原始質(zhì)粒后，取5 μl反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化DH5α即可完成克隆構(gòu)建，待鑒定。

1.5酶切鑒定

按照Gene JET Plasmid Miniprep Kit試劑盒說明書提取質(zhì)粒。內(nèi)切酶A 0.25 μl，內(nèi)切酶B 0.25 μl，雙酶切緩沖液1 μl，待鑒定質(zhì)粒1 μl定反應(yīng)體系，37℃酶切1 h進(jìn)行酶切鑒定。點(diǎn)樣5 μl酶切反應(yīng)體系進(jìn)行核酸電泳鑒定，判斷克隆是否為陽性。陽性克隆送樣測(cè)序驗(yàn)證定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果

2.1單堿基突變

為了提高7NB2AA藥物候選分子與其配體之間的親和力，利用分子模擬軟件Discovery Studio建模分析。模型顯示7NB2AA分子A102為關(guān)鍵位點(diǎn)，需要進(jìn)行A102V（GCT→GTT）單氨基酸突變。設(shè)計(jì)引物7NB2AA-F：AAACAGGCAAGATTGTTGACTAC AACT，7NB2AA-R：GTTTGTAGTTGTAGTCAACAATC TTG（方框標(biāo)記代表擬突變位點(diǎn)）。金斯瑞合成pUC57-7NB2AA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的序列，DpnI消化去除原始質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒，酶切鑒定、測(cè)序分析。結(jié)果顯示，酶切鑒定4個(gè)克隆中，其中3個(gè)為陽性克隆，送樣測(cè)序鑒定，序列和預(yù)期結(jié)果一致（圖2、圖3，封四）。環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)進(jìn)行基因單堿基定點(diǎn)突變高效可行。

M表示MarkerDL10000;1～4表示藥物候選分子7NB2AA 突變后NcoI和Xho I雙酶切

2.2酶切位點(diǎn)修改

信號(hào)肽后前6個(gè)氨基酸決定信號(hào)肽酶切割效率，對(duì)周質(zhì)空間分泌表達(dá)至關(guān)重要[13]。為了優(yōu)化藥物候選分子7NB2AA周質(zhì)空間表達(dá)，對(duì)信號(hào)肽后酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造。原始載體pUC57-7NB2AA的PelB信號(hào)肽后為NcoI酶切位點(diǎn)，編碼MG兩個(gè)冗余氨基酸殘基，+1蛋氨酸側(cè)鏈較大，不利于周質(zhì)空間表達(dá)。利用環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，刪除NcoI酶切位點(diǎn)和修改為BamHI小側(cè)鏈氨基酸（GS）。使用表1引物，pUC57-7NB2AA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的序列，DpnI消化去除原始質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒，酶切鑒定、測(cè)序。結(jié)果顯示，挑選克隆均為陽性，測(cè)序序列與預(yù)期一致，環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)高效可行（圖4、圖5，封四）。酶切位點(diǎn)修改在載體改造和表達(dá)量?jī)?yōu)化中使用頻繁。本研究通過環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)可以高效、快速實(shí)現(xiàn)酶切位點(diǎn)刪除和替換。

2.3片段刪除

載體構(gòu)建中片段刪除是分子生物學(xué)的常規(guī)操作。以7NB2AA蛋白表達(dá)質(zhì)粒為例，環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)將其PleB信號(hào)肽去除，改為胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物7NB2AA-sig-F：AAGAAGGAGATATACATATGCAGGT GCAACTGCAG，7NB2AA-sig-R：CTTTCCTGCAGTTG CACCTGCATATGTATATCTCC。pET26b-7NB2AA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的序列，DpnI消化切除原始質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒，酶切鑒定、測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，酶切鑒定有陽性克隆，送樣測(cè)序鑒定顯示PelB信號(hào)肽成功刪除（圖6、圖7，封四）。本研究證明環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)刪除基因片段可行。

3討論

環(huán)狀定點(diǎn)突變技術(shù)多用于單堿基突變，酶切位點(diǎn)修改和片段刪除報(bào)道較少。本研究擴(kuò)展了該技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍：①抗體藥物Fc結(jié)構(gòu)N297A，L235E和 M428L/N434S等突變改善抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）[14];②去除藥物研發(fā)篩選技術(shù)（單B細(xì)胞篩選技術(shù)[15]）的冗余酶切位點(diǎn)，加快藥物研發(fā)進(jìn)程;③去除藥物開發(fā)早期目標(biāo)蛋白攜帶的His6、HA或GFP等標(biāo)簽[16]，促進(jìn)藥物研發(fā)早期活性評(píng)價(jià)。本研究環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)刪除的PelB信號(hào)肽長(zhǎng)度僅為63 bp，理論可以實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)片段的刪除（筆者在XTEN融合蛋白技術(shù)研究中成功刪除1728 bp的片段）;此外，技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)1～6個(gè)堿基的任意突變，理論可以實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)堿基對(duì)發(fā)突變（限制因素為引物合成長(zhǎng)度），下一步研究擬證明該技術(shù)的最長(zhǎng)突變極限。

本研究驗(yàn)證了環(huán)狀定點(diǎn)突變技術(shù)在單堿基突變中應(yīng)用的可行性。此外，本研究證明該技術(shù)可進(jìn)行質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)刪除、替換和基因片段刪除等突變。環(huán)狀定點(diǎn)突變技術(shù)高效改造蛋白藥物關(guān)鍵氨基酸，去除的冗余酶切位點(diǎn)和蛋白藥物的冗余標(biāo)簽，在生物藥研發(fā)中備受青睞。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王秋穎.基因體外定點(diǎn)誘變技術(shù)[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（6）：124-126.

[2]Dong M，Wang F，Li Q，et al.A single digestion，single-stranded oligonucleotide mediated PCR-independent site-directed mutagenesis method[J].Appl Microbiol Biotechnol，2020，104（9）：3993-4003.

[3]Forloni M，Liu A，Wajapeyee N.Altered beta-Lactamase Selection Approach for Site-Directed Mutagenesis[J].Cold Spring Harb Protoc，2018，2018（8）：670-676.

[4]Xia Y，Li K，Li J，et al.T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis[J].Nucleic Acids Res，2019，47（3）：1-11.

[5]曹陽，李冬田，尹冰楠，等.重疊延伸PCR方法的建立與應(yīng)用[J].河北醫(yī)藥，2005，27（11）：803-804.

[6]劉玉冰，李曉霞，王寶利，等.一步PCR法在單堿基定點(diǎn)誘變中的應(yīng)用[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，13（1）：98-99.

[7]周亞芹，張洪梅，董艷，等.環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在單堿基定點(diǎn)誘變中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2009，37（5）：321-324.

[8]Crisci S，Amitrano F，Saggese M，et al.Overview of Current Targeted Anti-Cancer Drugs for Therapy in Onco-Hematology[J].Medicina（Kaunas），2019，55（8）：414.

[9]Qu G，Li A，Acevedo-Rocha CG，et al.The Crucial Role of Methodology Development in Directed Evolution of Selective Enzymes[J].Angew Chem Int Ed Engl，2020，59（32）：13 204-13 231.

[10]Sayous V，Lubrano P，Li Y，et al.Unbiased libraries in protein directed evolution[J].Biochim Biophys Acta Proteins Proteom，2020，1868（2）：140 321.

[11]She W，Ni J，Shui K，et al.Rapid and Error-Free Site-Directed Mutagenesis by a PCR-Free In Vitro CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenic System[J].ACS Synth Biol，2018，7（9）：2236-2244.

[12]Kanazashi Y，Hirose A，Takahashi I，et al.Simultaneous site-directed mutagenesis of duplicated loci in soybean using a single guide RNA[J].Plant Cell Rep，2018，37（3）：553-563.

[13]Watanabe K，Tsuchida Y，Okibe N，et al.Scanning the Corynebacterium glutamicum R genome for high-efficiency secretion signal sequences[J].Microbiology，2009，155（Pt 3）：741-750.

[14]Wang X，Mathieu M，Brezski RJ.IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions[J].Protein Cell，2018，9（1）：63-73.

[15]Wardemann H，Busse CE.Expression Cloning of Antibodies from Single Human B Cells[J].Methods Mol Biol，2019，1956：105-125.

[16]Strain-Damerell C，Burgess-Brown N.High-Throughput Site-Directed Mutagenesis[J].Methods Mol Biol，2019，2025：281-296.

（收稿日期：2020-05-19）