劉慶慶,張薇娜,劉 琴

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023)

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不同方法比較黃酮類(lèi)化合物抗氧化性及其構(gòu)效關(guān)系分析

劉慶慶,張薇娜,劉 琴*

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023)

通過(guò)三種化學(xué)抗氧化方法(DPPH、FRAP和ORAC法)以及細(xì)胞抗氧化方法(CAA法)對(duì)芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素4種黃酮甙元及它們的糖苷化合物抗氧化活性進(jìn)行比較研究,結(jié)果表明DPPH和FRAP法基本一致,芹菜素、牡荊素和異牡荊素這類(lèi)C環(huán)上無(wú)羥基且B環(huán)只有一個(gè)羥基的黃酮抗氧化性極低;在C環(huán)上的羥基相同時(shí),B環(huán)有3′,4′-鄰二羥基的木犀草素和槲皮素的抗氧化活性顯著高于僅含4′-OH的芹菜素和山奈酚;而ORAC法的結(jié)果與此相反。化學(xué)抗氧化測(cè)定結(jié)果均表明,當(dāng)C環(huán)羥基被取代形成3-O-連黃酮苷時(shí)其抗氧化活性減小;而A環(huán)上6、8號(hào)位的氫被取代形成C-連黃酮苷時(shí)其抗氧化性反而會(huì)增加。CAA法結(jié)果顯示,當(dāng)C環(huán)無(wú)羥基時(shí),B環(huán)只有一個(gè)4-OH的芹菜素及其黃酮苷無(wú)細(xì)胞抗氧化性,但B環(huán)有兩個(gè)羥基的木犀草素及其糖苷卻顯示出較強(qiáng)的氧化性。與化學(xué)抗氧化性不同,A環(huán)上C-連黃酮苷的抗氧化性低于其苷元,而C環(huán)O-連糖苷的影響則較為復(fù)雜。

黃酮,化學(xué)抗氧化性,細(xì)胞抗氧化性,構(gòu)效關(guān)系

正常的代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種形式的自由基,這些自由基與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理功能有關(guān)[1-2],但過(guò)剩的自由基會(huì)增加糖尿病、癌癥等疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。黃酮類(lèi)化合物是植物重要的次生代謝產(chǎn)物,其基本骨架結(jié)構(gòu)為兩個(gè)芳環(huán)(A環(huán)與B環(huán))通過(guò)一個(gè)三碳鏈(C環(huán))連接而成[5-6]。黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化能力,能有效清除自由基,因此被認(rèn)為具有抗衰老、降低慢性非傳染性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)的功能[7-8]。黃酮化合物的種類(lèi)繁多,其結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系是黃酮研究關(guān)注的焦點(diǎn)之一[9-10]。在這些研究中,不管是采用計(jì)算[11]還是實(shí)驗(yàn)方法,主要關(guān)注的是B環(huán)上3′,4′-位和C環(huán)上3-位羥基的影響以及C環(huán)C2=C3雙鍵的影響[12-15],而對(duì)于糖苷取代的影響,尤其是C-苷取代對(duì)抗氧化性影響的研究還很少。此外,大多數(shù)抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系研究采用單一的評(píng)價(jià)方法,而不同的抗氧化評(píng)價(jià)方法機(jī)理不同,因此所得到的抗氧化性結(jié)果之間有一定的差異,如Zhang等[16]的研究表明牡荊素在DPPH法中顯示出遠(yuǎn)低于槲皮素和蘆丁的抗氧化性,而在ABTS法中卻與蘆丁相當(dāng)。因此要全面了解黃酮類(lèi)化合物抗氧化的構(gòu)效關(guān)系需要通過(guò)多種方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

本文根據(jù)B環(huán)和C環(huán)上羥基的不同及糖苷的聯(lián)接方式不同,選取了芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素4種黃酮甙元及它們的糖苷化合物,通過(guò)三種化學(xué)抗氧化方法(DPPH、FRAP、ORAC法)和細(xì)胞抗氧化方法(CAA法)進(jìn)行抗氧化性評(píng)價(jià),并對(duì)它們的抗氧化構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芹菜素、牡荊素、異牡荊素、山奈酚、木犀草素、葒草素、異葒草素、金絲桃苷、蘆丁,純度≥98% 均購(gòu)自阿拉丁試劑公司;人肝癌細(xì)胞株 HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

Trolox(水溶性維生素E)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH自由基)、2,2′-偶氮二異基脒二鹽酸鹽(AAPH)、2,4,6-三(2′-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、熒光素鈉(Fluorescein disodium)、2′,7′-二氯熒光二乙酸(DCFH-DA)、細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜(DMSO) 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%(w/v)胰酶-EDTA消化液、胎牛血清(FBS)、雙抗(penicillin-striptomyin,liquid),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,噻唑藍(lán)) 購(gòu)自 HYCLONE公司。

甲醇、鹽酸、三氯化鐵、無(wú)水乙酸鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉 均為分析純 購(gòu)自南京化學(xué)試劑廠。

SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器公司(MD);UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;Milli-Q Academic超純水系統(tǒng) 美國(guó) Millipore公司;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司;HERA-cell150 CO2培養(yǎng)箱 美國(guó) Thermo公司;XD30 型倒置顯微鏡 舜宇公司;SX-500快速自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本TOMY Digital Biology公司;JA5003N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DPPH法 所有的黃酮化合物用甲醇配成濃度為0.4 mmol/L的溶液,根據(jù)Liu等[17]的方法進(jìn)行DPPH自由基清除率ΔA%的測(cè)定,同時(shí)以Trolox為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算結(jié)果(DPPH)以Trolox 當(dāng)量表示(mmol/mmol),即每毫摩爾樣品對(duì) DPPH清除能力相當(dāng)于Trolox 的毫摩爾數(shù)。

1.2.2 FRAP法 按照文獻(xiàn)[18]報(bào)道配制 TPTZ工作液。用甲醇配制濃度為0.5 mmol/L的樣品溶液,取0.1 mL樣品與 TPTZ 工作液0.9 mL及醋酸鈉緩沖溶液9.0 mL混合,避光封口于37 ℃水浴反應(yīng)30 min后測(cè)定596 nm處的吸光度值,同時(shí)以Trolox為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算結(jié)果(FRAP值)以Trolox 當(dāng)量表示(mmol/mmol),即每毫摩爾樣品對(duì)Fe3+-TPTZ還原能力相當(dāng)于Trolox 的毫摩爾數(shù)。

1.2.3 ORAC法 根據(jù)參考文獻(xiàn)中的方法[19],用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.2 mol/L)配制濃度均為1.0 μmol/L的樣品溶液,取100 μL樣品與50 μL熒光素鈉(0.4 μmol/L)在96孔板中混合,37 ℃下孵化15 min后快速加入50 μL AAPH溶液(66.66 mmol/L)。在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)538 nm下每隔1 min測(cè)定一次,100 min后記錄各樣品的熒光衰減曲線下面積(AUC值),同時(shí)以Torlox為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算結(jié)果(ORAC值)用Trolox當(dāng)量表示(mmol/mmol),即每毫摩爾樣品對(duì)氧自由基吸收能力相當(dāng)于Trolox的毫摩爾數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞抗氧化性(CAA)法

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[20],將人體肝癌細(xì)胞HepG2接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM作為培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液或者傳代,成長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 MTT實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)趨勢(shì)較好的HepG2細(xì)胞,消化后用培養(yǎng)液配制成濃度為2×104個(gè)/mL的細(xì)胞液,取100 μL細(xì)胞懸液加入無(wú)菌96孔板,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,再加入100 μL不同濃度(5、10、20、40、80、100、200、400 μmol/L)的樣品溶液(空白用DMEM代替),再培養(yǎng)24 h后加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄孔中液體,再加入200 μL DMSO,于避光37 ℃下充分震蕩30 min,測(cè)定570 nm處的OD值。計(jì)算不同樣品濃度下HepG2細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率(%)=(樣品的OD值/空白的OD值)×100 。

1.2.4.3 CAA實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)趨勢(shì)較好的HepG2細(xì)胞,消化后用培養(yǎng)液配制成濃度為6×104個(gè)/mL的細(xì)胞液,取100 μL加入96孔板,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去上清液,并用100 μL PBS清洗后加入25 μmol/L的DCFH-DA溶液與不同濃度的樣品溶液(5、10、20、40、80 μmol/L)各50 μL(空白用DMEM代替),繼續(xù)培養(yǎng)1 h后吸棄孔中液體,并立即加入100 μL 25 μmol/L的ABAP,在37 ℃下孵化,測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)538 nm的熒光值,每5 min測(cè)一次,共跟蹤測(cè)定60 min。

圖1 十種黃酮類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of flavonoids

按照如下公式計(jì)算不同黃酮類(lèi)化合物的細(xì)胞抗氧化活性(CAA)值:

用fa表示CAA值,fu表示(1-CAA)值,通過(guò)lg(fa/fu)與對(duì)應(yīng)樣品濃度的對(duì)數(shù)值lgC作圖,當(dāng)lg(fa/fu)=0時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為樣品清除氧化自由基的半數(shù)有效濃度即EC50值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±SD表示,所有顯著性分析均基于p<0.05的顯著水平。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同結(jié)構(gòu)黃酮化合物的化學(xué)抗氧化活性比較

圖1是本研究中所涉及的黃酮化合物結(jié)構(gòu)示意圖。

三種化學(xué)抗氧化方法(即DPPH、FRAP和ORAC法)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如下:A1=145.16B-2.0987,R2=0.9990;A2=0.3317 B+0.0444,R2=0.9993;A3=0.2109 B+0.3516,R2=0.9910。式中A1為DPPH自由基清除率,A2為FRAP法中的吸光度值,A3為ORAC法中的AUC值,B為T(mén)rolox的濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,十種黃酮化合物的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 十種黃酮類(lèi)物質(zhì)的DPpH、FRAP值和ORAC值
Table 1 DPPH、FRAP and ORAC values of ten flavonoids

樣品抗氧化能力mmol(Trolox)/mmol(樣品)DPPHFRAP值ORAC值芹菜素0019±00008g0137±0005f2569±0145ef牡荊素0050±00011f0172±0004e3707±0269a異牡荊素0057±00014f0181±0002e3754±0152a山奈酚0743±0023e1823±0045d3427±0201bc木犀草素1865±0017d1951±0021c1984±0142g葒草素1887±00049c2790±0036b2529±0033f異葒草素1900±0012c2756±0042b2576±0100ef槲皮素2199±0017a3790±0021a3406±0142b金絲桃苷2100±0017b2702±004b2943±0152cd蘆丁2061±0023c2672±0021b2853±0072d

注:肩標(biāo)字母不同表示差異顯著,p<0.05。

由表1可以看出,DPPH和FRAP法的測(cè)定結(jié)果基本一致,即槲皮素、金絲桃苷和蘆丁均顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力;其次是木犀草素、葒草素、異葒草素和山萘酚,而牡荊素、異牡荊素和芹菜素均顯示較低的抗氧化能力。在兩種方法中槲皮素均表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化性,而芹菜素則表現(xiàn)出最低的抗氧化性。但是,ORAC法的結(jié)果與前兩者均存在較大差異,前兩者測(cè)定中抗氧化性很低的芹菜素、牡荊素、異牡荊素和山奈酚在ORAC法中均表現(xiàn)出較高的抗氧化能力,其中牡荊素和異牡荊素抗氧化能力最高,約為T(mén)rolox的3.7倍。三種方法中的抗氧化性結(jié)果一致的是B環(huán)上均含兩個(gè)羥基的黃酮醇及其糖苷衍生物槲皮素、金絲桃苷和蘆丁的抗氧化性大于同樣是B環(huán)上有兩個(gè)羥基的黃酮及其黃酮苷木樨草素、葒草素和異葒草素;牡荊素、異牡荊素的抗氧化性大于芹菜素;葒草素、異葒草素的抗氧化性大于木樨草素;槲皮素的抗氧化性大于金絲桃苷和蘆丁。

2.2 黃酮類(lèi)化合物細(xì)胞抗氧化活性的比較

2.2.1 十種黃酮類(lèi)物質(zhì)的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞抗氧化性實(shí)驗(yàn)(CAA法)作為近年來(lái)廣泛使用的抗氧化能力測(cè)定方法,其以細(xì)胞為反應(yīng)主體,更加接近人體生理?xiàng)l件。在考察CAA前,必須先保證實(shí)驗(yàn)中所用濃度范圍內(nèi)的樣品不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,以防對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性的結(jié)果如圖2。

圖2 十種黃酮類(lèi)物質(zhì)在不同濃度下的細(xì)胞存活率Fig.2 Cell survival probability of ten flavonoids

由圖2可知,這十種黃酮類(lèi)物質(zhì)在濃度0～400 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)細(xì)胞存活率在90%～110%之間,細(xì)胞致死率在10%之內(nèi),不會(huì)對(duì)HepG2產(chǎn)生明顯毒性,所以樣品可在0～400 μmol/L范圍內(nèi)進(jìn)行CAA實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 十種黃酮類(lèi)物質(zhì)的CAA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖3為不同濃度的樣品對(duì)人體肝癌細(xì)胞HepG2中熒光強(qiáng)度的變化隨時(shí)間的動(dòng)力學(xué)曲線。由圖3可見(jiàn)山奈酚、木犀草素、葒草素、異葒草素、槲皮素、金絲桃苷和蘆丁這7種樣品濃度在5～80 μmol/L范圍內(nèi)隨著化合物濃度增加,細(xì)胞內(nèi)的熒光值顯著降低,說(shuō)明以上7種黃酮都能有效抑制細(xì)胞內(nèi)氧化自由基的產(chǎn)生,且其抗氧化能力與濃度正相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),芹菜素、牡荊素和異牡荊素這3種黃酮即使?jié)舛葟? μmol/L增加到400 μmol/L時(shí)其細(xì)胞熒光值的變化不明顯,這表明芹菜素、牡荊素和異牡荊素幾乎不表現(xiàn)出細(xì)胞抗氧化性,這與Wolfe等[9]人的研究結(jié)果一致。

根據(jù)有顯著細(xì)胞抗氧化活性的7種樣品的熒光曲線下積分面積(AUC值),按照1.2.4.3計(jì)算CAA 值,再通過(guò)對(duì)數(shù)法作lg(fa/fu)與lgC的線性回歸方程,當(dāng)lg(fa/fu)=0時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為樣品清除氧化自由基的半數(shù)有效濃度即EC50值(圖4),EC50值越低,表明其細(xì)胞抗氧化性越高。

圖4 七種黃酮抑制活性氧氧化DCFH的EC50值Fig.4 EC50 Values for inhibition of peroxyl radical-induced DCFH oxidation by seven flavonoids

由圖4可見(jiàn),除去不顯示細(xì)胞抗氧化性的芹菜素、牡荊素和異牡荊素外,木犀草素具有最高的細(xì)胞抗氧化性,山奈酚其次,葒草素和異葒草素這兩個(gè)木犀草素的C-連糖苷異構(gòu)體的抗氧化性低于山奈酚。盡管C環(huán)上多了一個(gè)羥基,但槲皮素的細(xì)胞抗氧化性反而低于B環(huán)羥基相同而C環(huán)無(wú)羥基的木犀草素;C環(huán)上被單糖取代的金絲桃苷的抗氧化性低于甙元槲皮素,而二糖取代的蘆丁反而高于甙元槲皮素。這與化學(xué)抗氧化性不同,說(shuō)明黃酮C環(huán)上的羥基可能對(duì)細(xì)胞抗氧化性的貢獻(xiàn)不起主要的作用。

2.3 抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系分析

2.3.1 化學(xué)抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系分析 研究表明,C環(huán)、B環(huán)的羥基是影響黃酮類(lèi)化合物的抗氧化性的主要因素。前線軌道理論和脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)表明,B環(huán)羥基是影響黃酮類(lèi)物質(zhì)抗氧化性的關(guān)鍵基團(tuán):孫慶雷[11]等人通過(guò)理論計(jì)算,說(shuō)明黃酮抗氧化性與B環(huán)羥基的位置及數(shù)量密切相關(guān);劉帥濤[14]等也通過(guò)對(duì)四種黃酮小分子清除DPPH自由基能力的比較發(fā)現(xiàn)B環(huán)上的鄰二酚羥基比只有一個(gè)4-OH結(jié)構(gòu)的抗氧化性強(qiáng),這與本研究的DPPH和FRAP結(jié)果一致,即C環(huán)沒(méi)有羥基且B環(huán)只有一個(gè)4′-OH的芹菜素、牡荊素和異牡荊素均表現(xiàn)出極低的抗氧化性。B環(huán)比山奈酚多一個(gè)3′-OH的槲皮素,其DPPH和FRAP值都約為山奈酚的2～3倍。

圖3 十種黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度-時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線的影響Fig.3 Effects of ten flavonoids on fluorescence in HepG2 cells

然而,與DPPH和FRAP法相反,在ORAC法中當(dāng)A環(huán)和C環(huán)相同,B環(huán)只有一個(gè)4′-OH的化合物的抗氧化性反而高于B環(huán)上含3′,4′-鄰二羥基的黃酮,如芹菜素、牡荊素和異牡荊素的抗氧化性分別高于木犀草素、紅草素和異葒草素;山萘酚的抗氧化性高于槲皮素。這與Tabart等[21]的報(bào)道相似,在他們的研究中分別采用了TEAC法、DPPH法和ORAC法對(duì)不同黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行抗氧化性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TEAC法和DPPH法中,槲皮素的抗氧化性高于山奈酚,但是在ORAC法中山奈酚的抗氧化性卻高于槲皮素。目前還沒(méi)有解釋這一現(xiàn)象的報(bào)道,這一差異可能與抗氧化機(jī)理有關(guān):前兩種方法中黃酮化合物的抗氧化性是分別基于電子轉(zhuǎn)移的自由基清除和氧化態(tài)的還原,而ORAC法是基于氫原子轉(zhuǎn)移的抗氧化劑與熒光探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合自由基的過(guò)程[22]。此外,溶劑體系的不同導(dǎo)致黃酮化合物的結(jié)構(gòu)差異可能是影響其抗氧化能力的原因之一:DPPH法采用的是有機(jī)溶劑體系,FRAP法采用的是酸性溶液體系(pH3.0),而ORAC法則是pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液體系,在前兩種方法中黃酮B環(huán)上的羥基氫不會(huì)發(fā)生解離,而在pH7.4的條件下,B環(huán)上有鄰二羥基的其中有一個(gè)氫可能會(huì)發(fā)生解離,而剩下的一個(gè)羥基就會(huì)跟鄰位的氧負(fù)離子形成氫鍵,導(dǎo)致其氫轉(zhuǎn)移能力下降,從而可能導(dǎo)致抗氧化能力有所下降,當(dāng)然這一推論的證明需要黃酮上不同酚羥基的解離常數(shù)為依據(jù)。4種甙元中的槲皮素和山奈酚抗氧化性高于芹菜素和木犀草素,可見(jiàn)在ORAC法中C環(huán)3-OH作用高于B環(huán)的鄰二羥基。

三種化學(xué)抗氧化性結(jié)果也有共同點(diǎn),如:槲皮素的抗氧化性高于木犀草素,山奈酚高于芹菜素,可見(jiàn)在A環(huán)和B環(huán)相同的情況下,C環(huán)含羥基的黃酮抗氧化性高于C環(huán)無(wú)羥基的化合物;再如金絲桃苷和蘆丁的抗氧化性低于槲皮素,說(shuō)明當(dāng)C環(huán)上的羥基被糖取代,形成O-連糖苷后會(huì)減弱其抗氧化性。郭春梅[12]等人通過(guò)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH,比較了黃酮類(lèi)化合物對(duì)·OH的清除能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)·OH的清除作用比蘆丁強(qiáng),這與本文的結(jié)果相似。林親錄[13]等人認(rèn)為黃酮類(lèi)成苷后位阻增大是導(dǎo)致抗氧化能力降低的原因;陸曦[23]等人比較了四種黃酮類(lèi)化合物及五種具有羥基的化合物對(duì)超氧自由基的清除能力,也發(fā)現(xiàn)槲皮素的抗氧化活性高于蘆丁。另外,葒草素和異葒草素的抗氧化性均高于木犀草素,牡荊素和異牡荊素的抗氧化性也高于甙元芹菜素,表明黃酮類(lèi)化合物A環(huán)的C-連糖苷反而增加抗氧化性,這在ORAC法中表現(xiàn)得更為突出,因此A環(huán)C-連糖苷可能會(huì)對(duì)抗氧化性有促進(jìn)作用,這可能是A環(huán)上C-苷取代會(huì)增加其鄰位及對(duì)位羥基的電子云密度,從而導(dǎo)致A環(huán)羥基的還原性增加。目前還很少有對(duì)這一類(lèi)黃酮化合物的抗氧化性進(jìn)行比較的報(bào)道。

2.3.2 細(xì)胞抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系分析 細(xì)胞抗氧化性(CAA)是測(cè)定抗氧化物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的能力。CAA法的結(jié)果中芹菜素、牡荊素和異牡荊素幾乎沒(méi)有細(xì)胞抗氧化性,說(shuō)明黃酮C環(huán)和B環(huán)羥基對(duì)其細(xì)胞抗氧化性也具有顯著的影響,C環(huán)無(wú)羥基且B環(huán)只有一個(gè)羥基的物質(zhì)無(wú)細(xì)胞抗氧化活性,這與Wolfe[9]和Hofer[24]的報(bào)道一致。但本研究中C環(huán)有一個(gè)羥基且B環(huán)有兩個(gè)羥基的槲皮素,其細(xì)胞抗氧化性比B環(huán)、C環(huán)各有一個(gè)羥基的山奈酚以及只B環(huán)有兩個(gè)羥基的木犀草素都低。該結(jié)果與Hofer等[24]的報(bào)道一致,在他們的研究中采用了細(xì)胞抗氧化性和細(xì)胞磷脂抗氧化性測(cè)定方法比較了包括槲皮素、木犀草素和山奈酚在內(nèi)的黃酮化合物的抗氧化性,結(jié)果表明木犀草素和山奈酚的細(xì)胞抗氧化性遠(yuǎn)高于槲皮素,與本文的結(jié)果相同,木犀草素略高于山奈酚。但是Wolfe等[9]的報(bào)道卻剛好相反,槲皮素表現(xiàn)出最好的抗氧化性,山奈酚緊隨其后。此外,在本研究中發(fā)現(xiàn)O-連糖苷對(duì)細(xì)胞抗氧化性的影響比較復(fù)雜,如甙元槲皮素強(qiáng)于單糖苷金絲桃苷而低于雙糖苷蘆丁。在Wolfe等[9]的報(bào)道中蘆丁沒(méi)有細(xì)胞抗氧化性,而在Tabart等[21]的研究中采用了血紅細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞抗氧化性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明楊梅素蕓香苷的細(xì)胞抗氧化性大于其對(duì)應(yīng)的甙元楊梅素,這與我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果槲皮素蕓香苷(蘆丁)的細(xì)胞抗氧化性高于槲皮素的結(jié)論相近。在本文的CAA實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),與化學(xué)抗氧化性不同,A環(huán)的C-連糖苷葒草素和異葒草素均低于其甙元木犀草素,有關(guān)A環(huán)C-連糖苷對(duì)其細(xì)胞抗氧化性的影響還鮮有報(bào)道。

3 結(jié)論

抗氧化能力是功能食品的標(biāo)簽之一。然而,目前還沒(méi)有任何一種方法可以準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)出食品的抗氧化性,這就需要對(duì)抗氧化成分的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入研究。本文采用三種化學(xué)抗氧化方法和細(xì)胞抗氧化方法,測(cè)定了十種黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性,基于溶劑體系對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)的影響和各自的反應(yīng)機(jī)理,由不同的化學(xué)抗氧化性測(cè)定結(jié)果得到的構(gòu)效關(guān)系既有共性,又有差異。與化學(xué)抗氧化方法相比,基于細(xì)胞的抗氧化測(cè)定方法更具有實(shí)際意義,但細(xì)胞抗氧化性強(qiáng)弱與樣品濃度、同質(zhì)膜的融合程度以及細(xì)胞透膜特性等密切相關(guān),實(shí)驗(yàn)方法也較為復(fù)雜。與黃酮類(lèi)化合物的化學(xué)抗氧化性報(bào)道相比,基于細(xì)胞的研究還很少,不同的研究中結(jié)果差異也較大,因此黃酮類(lèi)化合物細(xì)胞抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系仍需更深入的探索。

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Comparison studies on antioxidant capacities of flavonoids by different assays and the structure-activity relationship implication

LIU Qing-qing,ZHANG Wei-na,LIU Qin*

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

The antioxidant activities of four flavonoids(apigenin,kaempferol,luteolin,quercetin)and their glycosides were studied by using three chemical assays(DPPH,FRAP and ORAC assays)and cellular antioxidant activity(CAA)method. Both DPPH and FRAP assays showed that apigenin and its glucosides with only one-OH on B ring but without C-OH showed extremely low antioxidant capacity. Flavonoids with 3′,4′-OH on B-ring showed significant higher antioxidant activity than those had only one 4′-OH when they had same structure of C ring. For example,luteolin and quercetin had higher antioxidant activity than that of apigenin and kaempferol,respectively. In the mean time,ORAC assay gave a contrary result. All three chemical assays showed that the antioxidant activities were decreased when C-3-OH was substituted by glycosyl,which suggested that 3-OH on C-ring also contributed to antioxidant capability of flavonoids. Antioxidant capabilities of flavonoids were increased when A-ring was glycosylated at 6 or 8 position and formed C-glycosides. CAA results showed that apigenin and its glycosides with only one OH on B ring but no C-OH had no cellular antioxidant activity. Luteolin with two-OH on B-ring but no C-3-OH showed higher antioxidant activity. Unlike those chemical methods,C-glycosylation on A ring decreased the CAA of its aglycone. The antioxidant activity effect of O-glycosylation on C-ring was more complicated compared with chemical assays.

flavonoids;chemical antioxidant activity;cellular antioxidant activity;structure-activity relationship

2016-07-04

劉慶慶(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：liuqq0419@163.com。

*通訊作者:劉琴(1968-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)，E-mail：liuqin31@sina.com。

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目( 11KJA550001) ;江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

TS201.2

A

1002-0306(2016)23-0109-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.012