段淑芳胡 江繆 菁杜文喜

大黃酸對糖尿病大鼠腎臟系膜細(xì)胞炎癥因子的調(diào)控

段淑芳1胡 江1繆 菁1杜文喜2

目的觀察大黃酸（Rheic acid）對高糖（30mmol/L）誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）表達(dá)的影響，探討其腎臟保護(hù)的可能機(jī)制。方法大黃酸作用于高糖誘導(dǎo)的MsC，運(yùn)用MTS檢測細(xì)胞存活率，ELISA法測定細(xì)胞上清TGF-β1、MCP-1含量，RT-PCR法檢測MCP-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)量。結(jié)果與模型組（高糖30mmol/L）比較，大黃酸（62.5、125、250μg/mL）干預(yù)組MsC細(xì)胞存活率明顯上升（59%、75%、84%比53%，P＜0.05）。高糖（30mmol/L）作用于MsC細(xì)胞后，TGF-β1、MCP-1表達(dá)被激活，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大黃酸（62.5、125、250μg/mL）干預(yù)后，TGF-β1及MCP-1活性均被抑制，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論大黃酸可以通過調(diào)控MCP-1和TGF-β1表達(dá)，從而減少高糖誘導(dǎo)的MsC炎癥反應(yīng)。

大鼠；腎臟系膜細(xì)胞；大黃酸；TGF-β1；MCP-1

糖尿病腎?。―N）是全球終末期腎病的主要原因，終末期腎病有54%來自糖尿病腎病[1]。糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展與炎癥因子和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。前期研究[3]顯示，大黃酸可以明顯降低尿白蛋白排泄量，預(yù)防血肌酐水平的升高，但是具體機(jī)制不明確。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察大黃酸對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞（mesangial cell，MsC）的轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）1表達(dá)調(diào)控作用，闡述大黃酸延緩糖尿病腎病發(fā)展的可能機(jī)制，為糖尿病腎病防治和大黃酸的進(jìn)一步開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥材及制備 大黃酸（批號20121220，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)本校中藥鑒定室鑒定屬正品。大黃酸用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，加入無血清DMEM稀釋，并經(jīng)0.22μm過濾消毒備用。DMSO終濃度＜0.01%，以0.01%DMSO作為溶劑對照組，實(shí)驗(yàn)顯示溶劑對細(xì)胞無毒性作用。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，USA）（每升含10%胎牛血清，100U/mL的青霉素，100μg/mL的鏈霉素，2mM的L-谷氨酰胺，100μM的非必需氨基酸，1mM的丙酮酸，PH7.4）；胰酶（MERCK，USA）；鏈脲佐菌素（上海源葉生物科技有限公司，批號20121028）；MTS（Promega.USA）；二甲基亞砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司，批號2067B011）；ELISA試劑盒（ADL）；Tag酶；RT-PCR試劑盒（TAKARA）；TGF-β1引物、MCP-1引物、β-Actin（Invitrogen）。

1.3 方 法

1.3.1 大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）體外培養(yǎng) 細(xì)胞株MsC購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司，低糖（5.5mmol/L）DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代保存。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將生長良好的MSC調(diào)整細(xì)胞比例為2×106個/培養(yǎng)皿dish，接種于100mm dishes，待24h后細(xì)胞長滿，棄上清更換為無血清培養(yǎng)基，隨機(jī)分組為：正常組（MsC無任何誘導(dǎo)劑）；模型組：MsC+高糖（30mmol/L）DMEM培養(yǎng)基；大黃酸低劑量組：MsC+30mmol/L高糖+大黃酸62.5μg/mL；大黃酸中劑量組：MsC+30mmol/L高糖+大黃酸125μg/mL；大黃酸高劑量組：MsC+30mmol/L高糖+大黃酸250μg/ mL。各組更換無血清培養(yǎng)基后先給予相應(yīng)濃度各中藥干預(yù)4h，再加入終濃度為30mmol/L的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)作用18h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測。

1.3.3 指標(biāo)檢測 （1）細(xì)胞活力測定：MTS法。上述各組細(xì)胞藥物干預(yù)后繼續(xù)培育18h，每孔再加入20μL MTS，繼續(xù)培育4h，于酶標(biāo)儀上測定其490nm處的光密度OD值，以間接反映細(xì)胞存活率。（2）ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TGF-β1、MCP-1的含量：收集各組藥物干預(yù)后的上清，6000rpm離心6min，離去懸浮物。各樣本孔加入50μL樣品的空白微孔，加入10μL的生物素標(biāo)記液。同時在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中分別加入100μL的酶標(biāo)記溶液。最后36±2℃孵育反應(yīng)60min，洗板5次后，每孔加入底物顯色液A（3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，TMB）、B（0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L碳酸氫二鈉緩沖液，pH5.0～5.4）液各50μL（2mol/L H2SO4溶液），36± 2℃下避光孵育反應(yīng)15min，每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值。（3）RT-PCR檢測大黃酸對高糖誘導(dǎo)的MsC相關(guān)因子TGF-β1、MCP-1的基因表達(dá)：cDNA擴(kuò)增采用固定模式：95°C 4min；30個循環(huán) 94℃（30s），56℃（30s）和72℃（30s），72℃ 7min；最后一步冷卻。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTS測定細(xì)胞存活率 經(jīng)高糖作用后，MsC存活率53%，而加用高、中、低濃度的大黃酸干預(yù)組，細(xì)胞存活率明顯上升，分別為84%、75%、59%，大黃酸可減少高糖所致MsC細(xì)胞死亡，且存在劑量依賴關(guān)系，以大劑量大黃酸（250μg/mL）效果最佳，見表1。

表1 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞MsC存活率的影響（±s）

表1 大黃酸對高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞MsC存活率的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；MsC：大鼠腎臟系膜細(xì)胞；細(xì)胞存活率=各組OD值/正常組OD值

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2.2 大黃酸對高糖誘導(dǎo)MsC細(xì)胞的相關(guān)炎癥因子TGF-β1和MCP-1表達(dá)的調(diào)控 與正常組比較，模型組經(jīng)高糖（30mmol/L）作用于MsC后，細(xì)胞因子TGF-β1和MCP-1表達(dá)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度大黃酸（62.5、125、250μg/mL）干預(yù)后，TGF-β1和MCP-1活性均被抑制，與模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時存在劑量依賴關(guān)系，可見大黃酸可以顯著抑制被高糖激活的細(xì)胞因子TGF-β1和MCP-1表達(dá)量，以250μg/mL濃度效果最佳，見圖1（封二）。

2.3 大黃酸調(diào)控高糖所致MsC細(xì)胞相關(guān)基因TGF-β1和MCP-1的表達(dá) 與正常組比較，模型組經(jīng)高糖（30mmol/L）作用于MsC細(xì)胞后，TGF-β1和MCP-1表達(dá)均被激活，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。予大黃酸（62.5、125、250μg/mL）干預(yù)后，TGF-β1、MCP-1活性均被抑制，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見大黃酸可以顯著抑制被高糖激活的TGF-β1和MCP-1的基因表達(dá)，見圖2（封二）。

3 討論

糖尿病腎?。―N）的發(fā)生、發(fā)展與炎癥因子和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥級聯(lián)反應(yīng)引起胰島素抵抗和血流動力學(xué)改變，兩者共同參與了體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞表型和功能發(fā)生改變，糖尿病腎病的發(fā)生和持續(xù)性進(jìn)展[2]。因此抑制炎癥反應(yīng)，阻斷炎癥相關(guān)信號通路，保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞，對藥物干預(yù)糖尿病腎病具有重要意義。

在糖尿病腎病的發(fā)展過程中，眾多炎癥因子相互作用產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)。其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （TGF-β1）是已知的DN中致硬化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，可能通過蛋白激酶（MAPK）通路的級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致系膜增生等反應(yīng)[4-5]，胰島素增敏劑吡格列酮可以通過活化PPARγ通道，下調(diào)TGF-β1延緩腎損傷[6-7]。單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）與尿蛋白排泄率、腎小球和腎間質(zhì)損傷呈正相關(guān)，它的增高程度與DN發(fā)展一致[8]，通過抑制MCP-1的表達(dá)來抑制RAS系統(tǒng)活性，可以延緩糖尿病腎病的發(fā)展[9]。

糖尿病腎病屬中醫(yī)“濕濁”范疇，大黃具有清熱燥濕作用。大黃酸（Rhein）為大黃的重要成分之一，屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，前期研究證實(shí)大黃酸可以明顯降低尿白蛋白排泄量，預(yù)防血肌酐水平的升高[3]。但是具體機(jī)制不明確，限制了大黃的進(jìn)一步開發(fā)和臨床循證使用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖作用于大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）后，明顯增加了細(xì)胞死亡率，降低了正常細(xì)胞的存活率，而大黃酸可以有效減少高糖所致細(xì)胞死亡率，并且存在劑量依賴關(guān)系。同時，高糖作用于大鼠腎臟系膜細(xì)胞（MsC）后，炎癥因子TGF-β1、MCP-1的表達(dá)增多，而大黃酸可以有效減少TGF-β1、MCP-1的表達(dá)，同時存在劑量依賴關(guān)系，其中以250μg/mL作用最佳。細(xì)胞炎癥因子TGF-β1、MCP-1 的mRNA表達(dá)同樣說明，大黃酸可以有效減少被高糖激活的炎癥因子TGF-β1、MCP-1 mRNA表達(dá)，同樣存在劑量依賴關(guān)系，其中250μg/mL作用最佳。

本研究證實(shí)，大黃酸可以通過調(diào)控高糖誘導(dǎo)的MsC的細(xì)胞因子TGF-β1、MCP-1表達(dá)，有效抑制腎臟系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，延緩糖尿病腎病發(fā)展。

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（收稿：2015-12-08 修回：2016-03-21）

Effects of Rheic Acid on Inflammatory Cytokines in Rats with Diabetic Nephropathy

DUAN Shufang1,HUJiang1,MIAO Jing1,DU Wenxi21 Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Rheic acid on the expression of transforming growth factor-βl （TGF-β1）and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）on mesangial cells of high glucose（30mmol/L）induced diabetic rats and the mechanism under its renal protection.MethodsMesangial cells from diabetic rats induced by high glucose was treated with Rheic acid,then the cell survival rate was detected by using MTS method,the level of TGF-β1 and MCP-1in cell supernatant was determined with ELISA,and the mRNA transcription of MCP-1 and TGF-β1 was assessed by RT-PCR.ResultsCompared with model group（high glucose group）,the cell survival rate in Rheic acid groups（62.5,125,250μg/mL）increased（84%,75%,59%vs 53%,all P＜0.05）.The expression of TGF-β1 and MCP-1in high glucose-induced mesangial cells was increased compared with healthy mesangial cells（P＜0.05）,but the increase was significantly inhibited after the treatment of Rheic acid（62.5,125, 250μg/mL,all P＜0.05）.ConclusionRheic acid can alleviatehigh glucose-inducedinflammatoryresponse of mesangial cells by regulating the expression ofTGF-β1 and MCP-1.

rats;mesangial cells;Rheic acid;TGF-β1;MCP-1

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012ZB059）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81202709）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州 310005）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科（杭州 310006）

杜文喜，Tel：15858187089；E-mail：duanshufang2009@163.com