孫 帥，張慶霞，薛盧艷，劉金杰，唐 暉，劉 力,*

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2. 北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

Rapid HIT 200在法醫(yī)DNA檢驗中的應(yīng)用

孫 帥1，張慶霞2，薛盧艷2，劉金杰2，唐 暉2，劉 力2,*

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2. 北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

目的檢驗Rapid HIT 200系統(tǒng)快速檢測DNA的法醫(yī)學(xué)可應(yīng)用性。方法將血斑、唾液斑、脫落細胞及各種組織以該系統(tǒng)檢測，從靈敏度、適應(yīng)性、重復(fù)性和防污染等方面評估其效能。結(jié)果該系統(tǒng)檢測全血樣本（血液）靈敏度為1 μL，模板量30 pg左右；血斑、組織與唾液斑的檢出率均在80 %以上，但對脫落細胞僅為16 %；對測試的100個樣本中，未發(fā)生樣本自身或彼此間的轉(zhuǎn)移污染；對血斑、唾液斑、脫落細胞的重復(fù)性檢驗，其基因座一致性檢出率達90 %以上。結(jié)論該系統(tǒng)具備防污染能力，對常量檢材的檢測能力優(yōu)于微量。

Rapid HIT 200系統(tǒng)；STR基因座；靈敏性；適應(yīng)性；防污染；重復(fù)性

通常法醫(yī)DNA實驗室的檢驗工作流程包含四個步驟：（1）生物樣本的DNA提??；（2）聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）；（3）毛細管電泳分離；（4）選用軟件分析結(jié)果。一般需7～8 h完成。近十年來，DNA自動化分析技術(shù)取得了顯著進步，基因座數(shù)量的增加進一步提高了個體識別能力，耗時更短的PCR縮短了DNA定量和STR復(fù)制的過程[1-7]。正是由于更快速的檢測對于案件的偵查和審判更具時效性和價值，因此提高自動化程度，對生物檢材進行更快速檢測分析，是法醫(yī)工作者們永恒的追求。

應(yīng)用微流控芯片技術(shù)研發(fā)的Rapid HIT 200系統(tǒng)[8]（IntegenX, Pleasanton CA, USA) 集DNA提取、擴增、電泳和分析四大功能于一體，實現(xiàn)了樣品檢測自動化，降低了人為操作造成污染的風(fēng)險，檢驗可在2 h內(nèi)完成。本文應(yīng)用該系統(tǒng)，對其靈敏度、各種現(xiàn)場檢材的適應(yīng)性、可重復(fù)性、防污染等方面進行測試分析。

1 材料與方法

Rapid HIT 200系統(tǒng) (瑞捷200)，采用Promega的DNAIQTM進行樣品提取，適配兩種PCR試劑：Powerplex?16HS (Promega，USA)和GlobalFilerTM(Life Technologies, USA)，用8道毛細管電泳進行片段快速分離，結(jié)果分析應(yīng)用Gene Marker?HID軟件 (Soft Genetics, LLC）。8道毛細管中，5道為檢測樣本，其余3道分別為陰、陽性對照和Ladder。

因樣品在樣品盒中有可能發(fā)生漂移，因此使用Rapid HIT 200系統(tǒng)，最好對檢材作固定處理，該系統(tǒng)設(shè)有兩種檢測模式：一種針對于常量檢材，選用口腔拭子；另一種針對于微量檢材，選擇其他工具模式。常量模式的PCR循環(huán)次數(shù)比微量模式少兩個循環(huán)，電泳結(jié)束后，用Gene Marker HID?V2.6.13軟件對電泳數(shù)據(jù)進行STR分型。

1.1 靈敏性

針對檢材的靈敏性，將全血檢測分為兩類：一類為未稀釋的全血，分別取全血5、3、1 μL均勻地涂于棉簽頭部；另一類取5 μL全血分別按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶250的比例稀釋，而后分別取20 μL稀釋血均勻地涂于棉簽頭部，上述按照不同比例稀釋的血的實際含量分別相當(dāng)于全血量的3.3, 2.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0.13, 0.08 μL。自然陰干30 min后，將兩類樣本棉簽置于檢測通道中。

1.2 不同檢材適應(yīng)性

收集不同類型的檢材，包括血斑49份、唾液斑26份、組織(包括肌肉、皮膚、肝臟、脾臟、心臟和腦組織)40份、脫落細胞50份。

1.3 防污染性

系統(tǒng)運行時，樣本自身或彼此轉(zhuǎn)移過程中可能會發(fā)生污染，因此有必要評估其防污染能力。使用空白拭子即未使用過的棉簽，用于檢測樣本自身或在彼此轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生污染的可能性（測試空白拭子是否能檢出STR真峰，有檢出即發(fā)生了污染）。該系統(tǒng)的每次運行都設(shè)置空白拭子作檢測對照。

1.4 重復(fù)性研究

血斑來源于8名個體 (分別為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8)，分別重復(fù)檢驗次數(shù)為2、2、2、4、5、5、6、6；唾液斑來源于5名個體（分別為B1、B2、B3、B4、B5)，分別重復(fù)檢驗次數(shù)為2、3、3、3、6；脫落細胞樣本源于2名個體 (分別為C1、C2)，均重復(fù)檢驗2次。對檢出的基因座數(shù)量進行統(tǒng)計。

上述4種研究方法均采用GlobalFilerTM系統(tǒng)進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 靈敏性

即未稀釋的全血與稀釋后的全血（在不同稀釋比例條件下各取20 μL）所分別檢出基因座數(shù)目的比較。全血最低閾值含量的完整基因座檢出圖譜如圖1，檢出情況見表1。

圖1 全血最低閾值含量的基因座檢出完整圖譜Fig.1 The complete genetic profles detected under the lowest threshold of whole blood volume

2.2 不同檢材的適應(yīng)性

血斑、組織、唾液斑、脫落細胞檢出的等位基因百分比見表2。

2.3 污染的研究

本測試Rapid HIT 200系統(tǒng)共設(shè)置了100個空白拭子樣本，均未顯示發(fā)生樣本自身或彼此間的污染。

2.4 重復(fù)性

血斑、唾液斑、脫落細胞經(jīng)不同重復(fù)次數(shù)的檢測，其基因座一致性檢出率見表3。

3 討論

3.1 靈敏性

由表1可見，隨著全血量的減少，無論是未稀釋全血，還是稀釋全血，檢出基因座數(shù)目都呈遞減趨勢；同時盡管稀釋后全血實際含量≤未稀釋全血量，但檢出的基因座數(shù)目卻是對應(yīng)稀釋后全血≥未經(jīng)稀釋全血。這可能是稀釋的血液中抑制PCR反應(yīng)的血紅素含量減少所致。此外，未稀釋全血較稀釋后血因粘度原因從槍頭內(nèi)不能完全排凈，而使得實際被測血量亦即DNA量減少，也會使檢出基因座數(shù)目降低，或又是另一個原因。通過比較未經(jīng)稀釋和稀釋后全血所檢出的基因座數(shù)目，推測Rapid HIT 200系統(tǒng)檢測血液樣本的靈敏度為1 μL全血，即模板量30 pg左右。

表1 不同全血量的檢出情況Table 1 The detected STR loci numbers under various whole blood volumes

表2 不同類型檢材檢出情況匯總表Table 2 Ratio to total amount of each item by the respective item-different samples exposing their STR loci to certain extent

3.2 不同檢材的適應(yīng)性

當(dāng)檢出的等位基因數(shù)百分比在95 %～100 %區(qū)間時，血斑、組織、唾液斑樣本比例遠超半數(shù)，分別為91.8 %、80 %、100 %，而脫落細胞樣本的比例最低，僅為16 %。這是由于血斑、組織細胞、唾液斑等常量檢材的細胞含量大，DNA模板量高，故基因座數(shù)目檢出多，而微量檢材脫落細胞數(shù)量相對較少，模板量低，故檢出比例也就少。由此可見，Rapid HIT 200系統(tǒng)對常量檢材的檢測能力優(yōu)于微量檢材。但是，檢測樣本數(shù)的不同會影響檢出基因座的比率分布區(qū)間占比，比如，組織樣本數(shù)為12時，其檢出等位基因百分比區(qū)間50 %～80 %的檢材數(shù)為3（25 %），80 %～95 %區(qū)間是0，95 %～100 %區(qū)間為9（75 %）；而對于脫落細胞，當(dāng)樣本數(shù)為30時，其在50～80%檢出等位基因百分比區(qū)間的檢材數(shù)為20（66.7 %），80 %～95 %區(qū)間是2（6.7 %），95 %～100 %則為8（26.7 %）；與表2其各自檢材總數(shù)為40和50時所呈現(xiàn)的相應(yīng)比率分布區(qū)間明顯不同，概因低樣本數(shù)時檢材個體差異所導(dǎo)致的統(tǒng)計分布異常使然。因此，欲得到符合規(guī)律和常理的實驗結(jié)果，樣本總數(shù)不能太少。不過，這些結(jié)果恰也證明Rapid HIT 200系統(tǒng)能夠準確反映檢測樣本的真實情況。

3.3 污染的研究

在空白拭子中發(fā)現(xiàn)一些非特異性譜帶，即非等位基因基線位置出現(xiàn)一些未標(biāo)記的等位基因，但是其峰高均低于100 RFU，顯著低于從血拭子中獲得的特異性峰高。非特異性譜帶有拔起峰、釘子峰等，這幾類峰可采用Gene Marker HID?V2.6.13軟件加以分析刪除。對于在黃色和紫色條帶的空白拭子中觀察到的拔高偽峰，則可能是在沒有相匹配的STR-PCR復(fù)制子存在的情況下，毛細管電泳產(chǎn)生的信號強度過高所致[9]。因此，可排除所檢測的血拭子有外源性污染的問題。以上結(jié)果表明當(dāng)Rapid HIT 200系統(tǒng)由專業(yè)法醫(yī)學(xué)實驗人員操作時，從樣本進樣到圖譜顯示，應(yīng)不會有污染產(chǎn)生。

表3 不同樣本重復(fù)性研究基因座檢驗結(jié)果Table 3 Reproducible detectivity of the STR loci from the item-various samples

對于每一個空白拭子的各熒光條帶的峰信號強度要實驗確定其分析閾值（Analytical threshold，AT），該閾值可用于區(qū)別一個真正等位基因峰和基線雜信號。因藍色通道最小閾值為17RFU、綠色通道10RFU、黃色通道13RFU、紅色通道16RFU、紫色通道46RFU，故針對于所有熒光通道可設(shè)AT值為50RFU。

本測試結(jié)果表明，所有實驗樣本中空白拭子AT值均在50RFU以下；所有STR分型圖譜沒有雜峰，峰高比例均衡，故樣本運行中未發(fā)生樣本自身或彼此間轉(zhuǎn)移的污染。Rapid HIT 200系統(tǒng)的運行應(yīng)是防污染的。

3.4 重復(fù)性

血斑、唾液斑和脫落細胞的基因座一致性檢出率很高，均在90 %以上，可見Rapid HIT 200系統(tǒng)對常見樣本的重復(fù)性檢測性能好。Rapid HIT 200系統(tǒng)運行方便，具有快速便捷的優(yōu)點。本測試推測該系統(tǒng)檢驗血液樣本的靈敏度為1 μL全血，即DNA模板量30 pg左右，檢測常量檢材能力優(yōu)于微量檢材，具有防污染能力，對于血斑、唾液斑和脫落細胞等檢材均具有很高的重復(fù)性。故Rapid HIT 200系統(tǒng)可用于法醫(yī)DNA快速檢測，但其樣本適應(yīng)性還需進一步改善。

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The Applicability of Rapid HIT 200 Apparatus for Forensic DNA Test

SUN Shuai1, ZHANG Qingxia2, XUE Luyan2, LIU Jinjie2, TANG Hui2, LIU Li2,*
(1. The Forensic College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2. Beijing Identifcation Center for Public Security and Justice, Beijing 100192, China)

ObjectiveTo test the applicability of Rapid HIT 200 apparatus into quick detection of forensic DNA.MethodsRapid HIT 200 apparatus was used to test the samples including whole blood fluid, bloodstains, saliva stains, exfoliated cells and tissues, for evaluating its sensitivity, adaptability, reproducibility and preventability against contamination.ResultsThe sensitivity for testing whole blood fuid is 1μL, equivalent to 30 pg quantity of DNA template. For the quantity-eligible samples of tissues, bloodstains and saliva stains, more than 80 % of the tested genetic loci are shown their genotyping profles, whereas mere 16 % of the tested genetic loci are exposed for the exfoliated cells. Among the 100 samples processed by Rapid HIT 200 apparatus, no contamination occurs within the samples themselves or one another during their transferring or testing. The reproducibility and consistency of the tested genetic loci exceed 90% for either the bloodstains or saliva stains or exfoliated cells.ConclusionsRapid HIT 200 apparatus is capable of preventing contamination, applicable for detecting DNA extracted from both the quantity-normal samples and trifing ones albeit a better result prone to emerge for the former than the latter ones.

Rapid HIT 200 apparatus; STR loci; sensitivity; adaptability; preventability against contamination; reproducibility

DF795.2

B

1008-3650(2016)06-0500-04

2015-09-20

格式：孫帥，張慶霞，薛盧艷，等. Rapid HIT 200在法醫(yī)DNA檢驗中的應(yīng)用[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(6):500-503.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.017

孫帥（1989—），男，山西忻州人，碩士研究生，研究方向為DNA法醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用。E-mail: ss0030@163.com

* 通訊作者：劉力（1963—），男，遼寧沈陽人，主任法醫(yī)師，碩士，研究方向為法醫(yī)學(xué)。E-mail:13901212325@163.com