高 鵬， 覃詩(shī)琪， 唐美芳

（1.武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司技術(shù)中心，湖北 武漢 430074；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)華大教育中心，廣東 深圳 518083）

目前，干血斑除被廣泛應(yīng)用于各種新生兒遺傳代謝病篩查（“新篩”）檢測(cè)，在基于飛行質(zhì)譜或測(cè)序平臺(tái)的人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）、耳聾、地中海貧血等基因檢測(cè)領(lǐng)域也有所應(yīng)用。我國(guó)每年有1‰～3‰的新生兒存在聽(tīng)力損失，而其中約50%因遺傳導(dǎo)致[1]，新生兒耳聾基因檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)和干預(yù)遲發(fā)性和藥物性耳聾具有重要意義[2]。目前，“新篩”在我國(guó)東部地區(qū)已實(shí)現(xiàn)普及，西部地區(qū)的普及率也快速提高，部分地區(qū)的“新篩”費(fèi)用已被納入各類醫(yī)保體系中[3]。因此，通常需要處理大量需要同時(shí)做“新篩”和耳聾基因檢測(cè)的干血斑樣本，因此同一個(gè)采血卡樣本會(huì)被反復(fù)打孔取樣以完成不同類型的檢測(cè)，極大地增加了試驗(yàn)人員的工作量，甚至?xí)霈F(xiàn)因頻繁取樣使樣本不足而無(wú)法完成檢測(cè)的現(xiàn)象，為疾病篩查帶來(lái)諸多不便。

“新篩”需要提取血斑中的氨基酸和肉堿等胞外物質(zhì)，耳聾基因檢測(cè)需要提取細(xì)胞內(nèi)的核酸，兩者的目標(biāo)檢測(cè)物及其分布場(chǎng)所互不相同，因此本研究提出按先后順序依次提取同一個(gè)干血斑中胞外和胞內(nèi)產(chǎn)物，提取產(chǎn)物分別用于“新篩”和耳聾檢測(cè)。然而，基于串聯(lián)質(zhì)譜的“新篩”檢測(cè)通常先用甲醇提取干血斑中的代謝產(chǎn)物[4]，而甲醇可穩(wěn)固細(xì)胞結(jié)構(gòu)[5]，使細(xì)胞裂解的難度增大，給后續(xù)耳聾基因提取帶來(lái)一定困難。因此，為避免反復(fù)取樣，本研究在堿水煮沸法提取干血斑DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，以期實(shí)現(xiàn)用1個(gè)血斑先后完成“新篩”和耳聾的產(chǎn)物提取和檢測(cè)，從而提高篩查中心的檢測(cè)效率，促進(jìn)自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái)的搭建。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年9—11月江縣人民醫(yī)院、貞豐縣婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心和汝州市婦幼保健院用采血卡采集的出生24～72 h內(nèi)的新生兒足跟血樣本28例，其中陽(yáng)性樣本8例，陰性樣本20例。主要檢測(cè)包括耳聾基因GJB2、GJB3、12S rRNA、PDS在內(nèi)的20個(gè)相關(guān)基因位點(diǎn)。測(cè)試通過(guò)華大基因生命倫理評(píng)估，并與新生兒家屬簽訂知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 驗(yàn)證用現(xiàn)有方法提取“新篩”干血斑DNA的效果 現(xiàn)有提取方法：用打孔鉗打取直徑為3.20 mm的干血斑，加入100 μL無(wú)菌水洗滌血斑后去除上清，加入120 μL pH值為10的堿水，并在100 ℃條件下孵育12 min。實(shí)驗(yàn)組用該方法提取“新篩”干血斑中的核酸，對(duì)照組為用該方法提取同一樣本的新鮮血斑的核酸，每組完成6個(gè)重復(fù)。用QubitTM dsDNA HS Asaay Kit（美國(guó)Invitrogen公司）檢測(cè)提取的DNA濃度。將提取產(chǎn)物進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）獲得1975G＞C、1174A＞T、1226G＞A、2027T＞A、235delC、IVS7-2A＞G、1494C＞T、281C＞T、1555A＞G、299_300delAT、167delT、2162C＞T、176_191del16、1229C＞T、538C＞T、2168A＞G、547G＞A、IVS15+5G＞A、589G＞A靶序列產(chǎn)物，酶解去除體系中多余的脫氧核糖核苷酸，加入單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）序列特異延伸引物，在SNP位點(diǎn)上延伸1個(gè)與突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基，將產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化和飛行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜儀器為MassARRAY Analyzer 4（美國(guó)Agena Bioscience公司），比對(duì)2個(gè)組核酸提取濃度以及質(zhì)譜檢測(cè)情況。

1.2.2 測(cè)試堿水pH值和甲醇對(duì)“新篩”干血斑DNA提取和檢測(cè)的影響 將“新篩”干血斑用120 μL pH值分別為9、10、11、12 4個(gè)梯度的堿水煮沸12 min，每個(gè)梯度重復(fù)6次。此外，每個(gè)樣本補(bǔ)充1組提取前通過(guò)水洗去除干血斑上殘留的甲醇、氨基酸和肉堿等雜質(zhì)的對(duì)照，用于研究干血斑上殘留的雜質(zhì)對(duì)DNA提取以及最終檢測(cè)結(jié)果的影響。檢測(cè)所有樣本的提取濃度和質(zhì)譜結(jié)果。

1.2.3 測(cè)試堿水體積對(duì)“新篩”干血斑DNA提取和檢測(cè)的影響 分別用60、70、80、90 μL的上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳pH值的堿水提取“新篩”干血斑DNA并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，每個(gè)體積梯度完成4個(gè)平行測(cè)試；另用120 μL pH值為10的堿水從新鮮血斑中提取DNA并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，并以此為對(duì)照。綜合pH值梯度測(cè)試情況確定出針對(duì)“新篩”干血斑進(jìn)行DNA提取的優(yōu)化方案。

1.2.4 驗(yàn)證優(yōu)化方案對(duì)不同陽(yáng)性、陰性樣本的提取和檢測(cè)情況 選取已知為雜合陽(yáng)性、純合陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、復(fù)合陽(yáng)性、疑似雜合陽(yáng)性實(shí)為陰性、陰性的6種臨床檢測(cè)中出現(xiàn)過(guò)的樣本，每種類型的樣本各選取2例，按優(yōu)化方案進(jìn)行DNA提取，對(duì)照用120 μL pH值為10的堿水從新鮮血斑中提取DNA，提取產(chǎn)物經(jīng)多重PCR和質(zhì)譜檢測(cè)后，分析不同類型樣本DNA的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析提取濃度差異情況，用Excel 2016軟件分析變量之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用現(xiàn)有方法提取“新篩”干血斑DNA的結(jié)果

現(xiàn)有方法“新篩”干血斑和新鮮血斑核酸提取濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.262，P=0.022），該方法下的新鮮血斑的各位點(diǎn)全部被正常檢出，而6例“新篩”干血斑中有4例存在未被檢出的位點(diǎn)。見(jiàn)表1。

2.2 堿水pH值和甲醇等雜質(zhì)對(duì)“新篩”干血斑DNA提取和檢測(cè)的影響

干血斑中DNA的提取濃度隨堿水pH值的增大而增大（r=0.906，P=0.094），表明堿性環(huán)境有利于細(xì)胞破裂釋放核酸（表2）。所有位點(diǎn)與對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果完全一致，用pH值分別為9、10、11的堿水提取的產(chǎn)物均僅有1個(gè)位點(diǎn)（167delT）的信號(hào)響應(yīng)偏弱，而對(duì)照有2個(gè)位點(diǎn)信號(hào)響應(yīng)偏弱，表明“新篩”干血斑提取的產(chǎn)物檢測(cè)效果優(yōu)于新鮮血斑。此外，雖然在不洗的情況下，用pH值為12的堿水提取的DNA濃度比用pH值為11的堿水提取的DNA濃度顯著提高（t=4.089，P=0.002），但用pH值為12的堿水提取的產(chǎn)物信號(hào)響應(yīng)弱的基因位點(diǎn)數(shù)明顯增多（表2、表3）。用pH值為12的堿水提取的產(chǎn)物的各位點(diǎn)信號(hào)響應(yīng)值整體偏低（圖1）。因此，用pH值為12的堿水提取的產(chǎn)物檢測(cè)質(zhì)量明顯下降，而pH值為11的堿水是提取“新篩”干血斑DNA較理想的條件。

表2 用不同pH值堿水從6個(gè)“新篩”干血斑中提取的DNA位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度

表3 不同pH值堿水從6個(gè)“新篩”干血斑中提取的DNA濃度

“新篩”檢測(cè)后的干血斑上有甲醇、氨基酸和肉堿等殘留的物質(zhì)，用pH值為9、10、11的堿水提取DNA前，這些雜質(zhì)會(huì)影響DNA的提取以及酶反應(yīng)[6]。表3中的提取濃度顯示，對(duì)“新篩”干血斑水洗除雜的6組樣本和不水洗的6組樣本的提取濃度之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[pH值9（t=0.350，P=0.733），pH值10（t=0.228，P=0.824），pH值11（t=0.012，P=0.991）]。此外，圖1中的質(zhì)譜峰圖顯示，對(duì)干血斑水洗除雜和不水洗的處理中各位點(diǎn)質(zhì)譜結(jié)果高度一致，表明“新篩”干血斑上的雜質(zhì)不會(huì)顯著影響DNA提取和質(zhì)譜結(jié)果。

圖1 不同pH值的堿水從“新篩”干血斑中提取的產(chǎn)物的各位點(diǎn)質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)結(jié)果

2.3 堿水體積對(duì)“新篩”干血斑DNA提取和檢測(cè)結(jié)果的影響

當(dāng)堿水體積分別為60、70、80、90 μL時(shí)，“新篩”干血斑的DNA濃度分別為（0.34±0.08）、（0.30±0.09）、（0.26±0.08）、（0.24±0.05）ng/μL，用不同堿水體積提取的DNA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。堿水體積為80 μL時(shí)，提取的“新篩”干血斑的DNA濃度與對(duì)照[（0.25±0.08）ng/μL]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。用60、70、80 μL堿水提取的DNA的各位點(diǎn)質(zhì)譜結(jié)果與對(duì)照完全一致。如圖2（a）所示，用90 μL堿水從樣本1～4中提取的DNA產(chǎn)物的547G＞A位點(diǎn)，因信號(hào)響應(yīng)極弱而未被檢出；圖2（b）顯示同一樣本的新鮮血斑的547G＞A位點(diǎn)雖然被檢出，但信號(hào)響應(yīng)同樣較弱，表明該樣本的547G＞A位點(diǎn)本身較難被檢出。對(duì)含有較難被檢出的位點(diǎn)的樣本，用體積超過(guò)90 μL的堿水從“新篩”干血斑中提取總DNA進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)失敗的風(fēng)險(xiǎn)增大；圖2（c）為其他樣本新鮮血斑的547G＞A位點(diǎn)峰圖，可見(jiàn)信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng)，此時(shí)引物峰較低，表明引物峰和產(chǎn)物峰的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度的比值可影響儀器的判讀結(jié)果。80 μL pH值為11的堿水是提取“新篩”干血斑DNA的較理想的條件。

圖2 547G＞A位點(diǎn)引物峰和產(chǎn)物峰信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系

2.4 優(yōu)化方案對(duì)不同陽(yáng)性及陰性樣本的提取和檢測(cè)情況

優(yōu)化方案下“新篩”干血斑分別為0.26和0.28 ng/μL，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.617，P=0.545）。此外，表4顯示，所有類型的樣本的質(zhì)譜結(jié)果和對(duì)照一致，其中對(duì)照中12個(gè)新鮮血斑所有位點(diǎn)的總未檢出率為1.0%，而“新篩”干血斑為0.5%，表明優(yōu)化方案從干血斑中提取的產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于從對(duì)照中提取的產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果。

表4 優(yōu)化方案下不同突變類型的2種血斑的質(zhì)譜檢測(cè)情況

3 討論

水洗“新篩”干血斑可去除大部分甲醇、鹽離子、氨基酸和肉堿等雜質(zhì)，有利于后續(xù)的提取和擴(kuò)增反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，pH值為9、10、11 時(shí)，水洗和不水洗干血斑均不影響DNA提取濃度，而pH值為12時(shí)不水洗和水洗處理的DNA提取濃度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.620，P=0.026），導(dǎo)致這種現(xiàn)象的因素有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以探明。此外，用pH值為12的堿水提取時(shí)，DNA濃度雖高，但樣本的各位點(diǎn)信號(hào)響應(yīng)值均較低，而在擴(kuò)增時(shí)模板的體積占整個(gè)體系的20%，模板可能導(dǎo)致擴(kuò)增體系堿性偏大，進(jìn)而抑制體系中酶的反應(yīng)效率[7]，最終導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有偏差。

在擴(kuò)增反應(yīng)中，引物二聚體的形成和非特異性擴(kuò)增是限制PCR敏感性的重要因素[8]，引物用量大、片段長(zhǎng)等一些特殊因素會(huì)使擴(kuò)增體系出現(xiàn)大量引物二聚體[9]，導(dǎo)致目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)量降低，目前針對(duì)引物二聚體的形成因素已經(jīng)產(chǎn)生了包括用熱啟動(dòng)酶在內(nèi)的許多嘗試[10]。從圖2可以看出：547G＞A位點(diǎn)信號(hào)響應(yīng)值低時(shí)，引物峰高而產(chǎn)物峰低；而該位點(diǎn)響應(yīng)值高時(shí)，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物峰高而引物峰低。質(zhì)譜峰圖信號(hào)強(qiáng)度與體系中對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物的含量呈正相關(guān)，引物峰高表明在擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生了大量的引物二聚體。本研究發(fā)現(xiàn)，用60、70、80 μL堿水提取DNA時(shí)各位點(diǎn)信號(hào)響應(yīng)正常，用90 μL堿水提取DNA時(shí)547G＞A位點(diǎn)未被檢出，而用90 μL堿水提取的DNA濃度也最低。因此，擴(kuò)增模板量低可能是形成引物二聚體的一個(gè)重要因素[11]，即模板DNA濃度偏低造成547G＞A位點(diǎn)基因與引物分子碰撞結(jié)合的概率降低，引物自身結(jié)合概率相對(duì)增大并形成二聚體，二聚體進(jìn)一步競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶、脫氧核糖核苷酸等，最終導(dǎo)致547G＞A位點(diǎn)基因擴(kuò)增產(chǎn)量不足。

隨著我國(guó)鼓勵(lì)生育政策的持續(xù)推廣，以及醫(yī)保體系的快速覆蓋[12]，新生兒數(shù)量在未來(lái)一段時(shí)期內(nèi)會(huì)不斷增長(zhǎng)，而包括“新篩”在內(nèi)的許多其他篩查項(xiàng)目也會(huì)逐步被納入醫(yī)保范圍，“新篩”也將覆蓋更多的地區(qū)和人群。然而，基于我國(guó)較大的人口基數(shù)，各地的篩查中心將迎來(lái)龐大的“新篩”樣本量，尤其是在人口密集且醫(yī)療條件相對(duì)滯后的地區(qū)，篩查中心將面臨高負(fù)荷的運(yùn)營(yíng)狀態(tài)。因此，在保證篩查質(zhì)量的同時(shí)，簡(jiǎn)化流程和引進(jìn)自動(dòng)化設(shè)備，從而提升篩查效率將成為未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。本研究用同一干血斑先后完成“新篩”和耳聾基因檢測(cè)，一定程度上縮短了耳聾檢測(cè)周期，同時(shí)減輕了取樣環(huán)節(jié)帶來(lái)的較大工作負(fù)擔(dān)。此外，在完成耳聾基因檢測(cè)后，從“新篩”干血斑中提取的DNA仍有大量剩余，在后期仍有用于其他類型基因檢測(cè)的潛力。