金方方， 金子錚， 劉 寧， 婁金麗

（首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌的90%以上，居我國惡性腫瘤病因的第4位，腫瘤致死病因的第3位，全球每年有50%以上的HCC新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在我國[1-2]。HCC起病隱匿、早期癥狀不典型，多中心發(fā)生，發(fā)現時多處于中晚期且伴隨不同程度的肝硬化，手術切除率低，具有易早期播散、轉移的特點。目前，臨床常用的HCC治療方法有手術切除、肝動脈導管化療栓塞、射頻消融、肝移植等。這些治療方法雖然能去除局部的病灶，但遠期效果并不十分理想，術后5年復發(fā)率高達75%[3]，術后5年生存率僅為30%～40%[4]。因此，尋找與肝癌術后復發(fā)相關的指標有助于盡早發(fā)現復發(fā)的腫瘤，改善患者預后。在外周血單個核細胞中有一類具有CD3高表達現象的T淋巴細胞（CD3brightT細胞），該群細胞分布廣泛，具有反應迅速、升高明顯、增殖能力強、持續(xù)時間長等免疫反應特點，與感染及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5]。本研究擬探討CD3brightT細胞在HCC患者術后復發(fā)中的提示作用，為HCC臨床診療提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2013年1月—2018年6月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院確診為HCC的患者69例，其中男53例、女6例，年齡49～72歲；69例患者中，有47例患者接受抗病毒治療，22例患者未接受抗病毒治療。TNM分期Ⅰ期19例、Ⅱ期32例、Ⅲ期8例。所有患者均有完整的病歷資料及長期門診復診或住院治療記錄，具體時間間隔為：術后半年內每月復查1次肝臟電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或B超、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、肝功能，半年后每3個月復查1次，2年后每6個月復查1次，以術后5年或死亡為研究終點。復發(fā)以影像學診斷為準，如B超、CT、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、肝動脈造影等，單純AFP升高不作為復發(fā)的標準。所有患者術前均有乙型肝炎病史，均無糖尿病、甲狀腺功能異常以及自身免疫性肝病等自身免疫性疾病史，且均未進行過免疫治療。根據臨床資料統計患者5年內的復發(fā)情況：5年內復發(fā)52例，未復發(fā)17例。

1.2 病例入選、排除標準

入選標準：經術后病理或肝穿刺病理活檢確診為HCC的患者。排除標準：肝功能異常（術前Child-Pugh分級為C級）；術前有感染，如肺炎、腹膜炎、尿路感染等；術后病理或肝穿刺病理活檢未證實為HCC；失訪。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 根據HCC臨床分期及肝功能情況，經臨床術前準備、保肝治療后，行肝葉切除、肝葉不規(guī)則切除或介入（肝動脈化療栓塞、射頻消融）治療。

1.3.2 相關指標的檢測 分別采集所有患者術后1個月、復查及復發(fā)時的靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，充分混勻，采用熒光抗體CD3-藻紅蛋白花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PeCy5）、CD8-藻紅蛋白-德克薩斯紅（phycoerythrin and Texas red tandem，ECD）、CD4-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）（美國BD公司）標記淋巴細胞，用溶血劑溶解紅細胞，離心，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗2次，采用BD FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）進行檢測。采用Kaluza Analysis軟件（美國Beckman Coulter公司）分析CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞分別占總T細胞的百分比（CD3%、CD4%、CD8%），計算CD4/CD8比值。設門圈出CD3brightT細胞占CD3+T細胞的百分比（CD3bright%）。同時采用cobas e601全自動免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發(fā)光法）檢測血清AFP水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件及GraphPad Prism 7軟件進行統計分析。呈非正態(tài)分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數Mann-Whitney U檢驗。采用Logistic回歸分析（前向逐步法）評估各項目對HCC復發(fā)的提示作用。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD3bright T細胞表型特征分析

CD4+CD8雙參數設門顯示CD3brightT細胞不表達CD4分子，少部分表達CD8分子，主要為CD4-CD8-T細胞。見圖1。

圖1 CD3bright T細胞表型特征分析

2.2 復發(fā)組與未復發(fā)組各項指標的比較

復發(fā)組AFP、CD4%、CD8%高于未復發(fā)組（P＜0.01），CD3bright%低于未復發(fā)組（P＜0.01）。CD3%和CD4/CD8比值2個組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 HCC復發(fā)患者術后及復發(fā)時各項指標的比較

與術后比較，復發(fā)時患者血清AFP水平明顯升高（P＜0.01）、CD3bright%降低（P=0.04），其他指標2個組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 AFP、CD3%、CD4%、CD8%、CD4/CD8比值及CD3bright%與HCC術后復發(fā)的關系

單變量Logistic回歸分析結果顯示，AFP、CD3%、CD8%及CD3bright%與HCC術后復發(fā)有關[比值比（odds ratio，OR）分別為1.012、1.033、1.048和0.841，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為1.001～1.023、1.006～1.060、1.016～1.081、0.785～0.900。

多變量Logistic回歸分析結果顯示，AFP、CD3bright%與HCC術后復發(fā)獨立相關（OR值分別為1.012和0.841，95%CI分別為1.001～1.023和0.783～0.902）。見表3。

表1 復發(fā)組與未復發(fā)組各項指標的比較 M（P25～P75）

表2 復發(fā)患者術后及復發(fā)時各項指標的比較 M（P25～P75）

表3 AFP、CD3%、CD4%、CD8%、CD4/CD8比值及CD3bright%與HCC術后復發(fā)的單變量和多變量Logistic回歸分析結果

3 討論

HCC的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能密切相關，針對HCC的免疫學研究一直是重點和熱點。以T細胞為主導的細胞免疫反應在HCC患者免疫監(jiān)視、殺傷和調節(jié)中扮演著重要角色。T細胞主要分為CD4+T細胞亞群和CD8+T細胞亞群。CD4+輔助T細胞可直接或通過分泌細胞因子，如干擾素-γ（interferon gamma，IFN-γ）、干擾素-α（interferon alpha，IFN-α）等起殺傷腫瘤細胞的作用[6]。CD8+細胞毒性T細胞和CD4+細胞毒性T細胞分別通過人類白細胞抗原Ⅰ類和Ⅱ類實現對腫瘤細胞的監(jiān)視及殺傷作用?？鼓[瘤T細胞數量減少和功能障礙可減弱機體對腫瘤細胞的殺傷作用，抑制性調節(jié)T細胞數量增加可抑制機體免疫功能，導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[7-8]，促進腫瘤的復發(fā)與轉移。由此可見，T細胞亞群在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但與HCC復發(fā)的關系尚不明確。本研究結果顯示，復發(fā)組CD4%、CD8%高于未復發(fā)組（P＜0.01），CD4/CD8比值差異無統計學意義（P＞0.05）。提示CD4/CD8比值雖可在一定程度上反映HCC患者免疫系統的紊亂，但對于復發(fā)的提示作用有限。

根據T 細胞表面C D 3 分子的表達可區(qū)分C D 3brightT 細胞亞群。C D 3brightT細胞亞群在健康人群中普遍存在，有8 0%～8 4%的人均可檢測到該細胞群，占外周循環(huán)中T 細胞的3.1 5%±2.6 0%[5，9]。本研究結果顯示，HCC患者CD3brightT細胞主要為CD4-CD8-T細胞，與文獻報道一致[5，9]。PAGET等[10]對純化的CD3brightT細胞進行特征分析，CD3brightT細胞為γδT細胞，主要分布于皮膚及黏膜等屏障部位，在早期防御病原體中發(fā)揮重要作用。CD3brightT細胞還共表達趨化因子受體6（chemokine receptor 6，CCR6）和趨化因子受體2（chemokine receptor 2，CCR2）。當發(fā)生炎癥時可通過下調白細胞介素（interleukin，IL）-23介導的穩(wěn)態(tài)受體CCR6，驅動CD3brightT細胞快速聚集到遠處的炎癥部位，參與屏障部位以外的免疫反應[11]。CD3brightT細胞在腫瘤的進展中也扮演著重要角色。作為固有免疫細胞，CD3brightT細胞可通過提供IFN-γ等炎性細胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用[12-13]。目前，對IL-17介導的促腫瘤學說尚存在爭議。有研究結果顯示，CD3brightT細胞可通過分泌IL-17，促進腫瘤部位血管的生成及腫瘤細胞的生長轉移[14]。還有研究結果顯示，IL-17可通過促進腫瘤部位中性粒細胞的浸潤與活化而抑制腫瘤的生長[15]。BAO等[16]的研究結果顯示，非小細胞肺癌患者外周血中CD3brightT細胞水平低于健康人。本研究結果顯示，術后5年內復發(fā)的HCC患者外周血CD3brightT細胞水平顯著低于未復發(fā)患者，且在復發(fā)時進一步降低。多變量Logistic回歸分析結果顯示，AFP、CD3bright%與HCC術后復發(fā)獨立相關（OR值分別為1.012和0.841，95%CI分別為1.001～1.023和0.783～0.902）。較低的CD3brightT細胞水平與HCC較差的預后及高復發(fā)率相關，具體機制還有待進一步研究。

總之，較低的CD3brightT細胞水平與HCC較差的預后及較高的復發(fā)率有關。對CD3brightT細胞在HCC患者免疫抑制狀態(tài)中的作用進行研究有助于為HCC患者的免疫治療提供新的靶點。由于本研究為回顧性分析，且回顧時間為5年，可持續(xù)跟蹤的病例數有限，因此有關CD3brightT細胞在HCC中的作用還有待進一步深入研究。