周 佳， 金 博， 肖 楠， 黃 磊， 孫立穎

（1.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034； 2.北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 102218）

快生長(zhǎng)分枝桿菌（rapidly growing Mycobacterium，RGM）可引發(fā)軟組織感染和肺部感染等多種疾病[1]。RGM主要分為偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群、龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群和恥垢分枝桿菌復(fù)合群，這些亞種復(fù)合群的共同點(diǎn)是都具備特征性的長(zhǎng)鏈脂肪酸——分枝菌酸，7 d內(nèi)可在多種固體培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)出肉眼可見的菌落，3 d～2周保持芳基硫酸酯酶活性，并且不產(chǎn)生或較慢產(chǎn)生任何色素[2-3]。偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群包括2個(gè)已知種和1個(gè)至少包括1個(gè)種的不明分類群[4]，鼻疽分枝桿菌、塞內(nèi)加爾分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌等一系列分枝桿菌都屬于這個(gè)復(fù)合群[5]。龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群[6]還包括2001年被發(fā)現(xiàn)的Mycobacterium immunogenum[7]。恥垢分枝桿菌復(fù)合群包含Mycobacterium goodii和Mycobacterium wolinskyi[8]。在分子生物學(xué)證據(jù)出現(xiàn)之前，龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群和偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群中的成員被認(rèn)為是亞種或只是不同血清型，但16S rDNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)這些血清型或亞種其實(shí)更有可能是不同的種。本研究選取北京大學(xué)第一醫(yī)院2010年以來分離到的3株RGM，其中2株是泌尿外科手術(shù)切口感染病原菌，另外1株是外傷感染病原菌，分別采用激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測(cè)和16S rDNA、rpoB基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定，并分析其藥物敏感性，以加強(qiáng)臨床對(duì)RGM的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集北京大學(xué)第一醫(yī)院2010年以來分離自3例患者的3株RGM。（1）患者1。男，22歲。既往體健，否認(rèn)傳染病和遺傳病史。自訴1年前左足曾被釘子扎傷2個(gè)月后局部腫脹化膿，合并左腹股溝淋巴結(jié)多發(fā)腫大，右側(cè)胸腔積液，發(fā)熱，經(jīng)外院診斷為分枝桿菌感染。經(jīng)清創(chuàng)及抗菌治療后創(chuàng)面愈合。后左足膿腫復(fù)發(fā)，清創(chuàng)換藥后傷口愈合出院。4個(gè)月后再?gòu)?fù)發(fā)，膿液送檢驗(yàn)科細(xì)菌室，檢出RGM。（2）患者2。女，52歲。因“右腎上腺囊腫”，于外院行腔鏡手術(shù)，術(shù)后低熱，右腰部切口紅腫、破潰、流膿、不愈，清創(chuàng)縫合術(shù)后切口再次紅腫破潰，B超提示右腰部瘢痕下積膿，自訴患高血壓、慢性乙型肝炎6年，病情平穩(wěn)，否認(rèn)患其他慢性病。傷口膿液送細(xì)菌室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，并查抗酸桿菌，結(jié)果陰性。手術(shù)擴(kuò)創(chuàng)后取壞死組織再送檢驗(yàn)科延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間查致病菌，結(jié)果回報(bào)確認(rèn)RGM。（3）患者3。男，60歲。否認(rèn)有慢性病史。4個(gè)月前因左腎積水和無(wú)功能于外院行左側(cè)輸尿管切除術(shù)。手術(shù)成功，且無(wú)術(shù)后感染跡象，遂出院。3個(gè)月前無(wú)誘因發(fā)現(xiàn)左腰部原引流口有血性滲出液，未明確診斷病原菌，傷口遷延不愈形成竇道，后經(jīng)竇道內(nèi)肉芽組織培養(yǎng)，確診RGM感染。

1.2 儀器與試劑

哥倫比亞血平皿（英國(guó)OXOID公司），抗酸染色液[貝索（中國(guó)）公司]，質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 樣本接種于哥倫比亞血平皿，35℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)72 h，形成特征性菌落。采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌種鑒定，并進(jìn)行抗酸染色，同時(shí)送菌懸液進(jìn)行16S rRNA和rpoB基因測(cè)序，16S rRNA引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；rpoB引物為：5'-CGACCACTTCGGCAACCG-3'和5'-TCGATCGGGCACATCCGG-3'。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用E-test法對(duì)3株RGM進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，折點(diǎn)參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)M24-A2文件[9]。配制0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙海愿鐐惐葋喲矫鬄榕囵B(yǎng)基，72 h后判讀結(jié)果；對(duì)克拉霉素的藥物敏感性7 d后判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RGM感染患者臨床特征總結(jié)

3例RGM感染患者中，2例泌尿系手術(shù)后傷口形成感染性竇道，1例足部外傷后感染，并累及腘窩淋巴結(jié)。3例患者病程均在4個(gè)月以上，感染創(chuàng)口和竇道均較深，除抗菌藥物治療外，均需外科切開清創(chuàng)引流，引流液、膿液無(wú)臭味，創(chuàng)面可產(chǎn)生肉芽組織，并受累淋巴結(jié)炎性反應(yīng)?？咕幬镉盟帟r(shí)間均在1個(gè)月以上，期間可繼發(fā)金黃色葡萄球菌等細(xì)菌感染。3例患者均無(wú)導(dǎo)致免疫抑制的基礎(chǔ)病。

患者1：手術(shù)2個(gè)月后左足膿腫未檢出分枝桿菌，結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)++，傷口膿液檢出銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌；術(shù)后4個(gè)月查體見左足小膿包破潰，左腘窩出現(xiàn)軟質(zhì)包塊，觸之有輕壓痛，切口按壓可有少量膿液，左腹股溝可及腫大淋巴結(jié)。臨床使用左氧氟沙星0.75 g，每日1次；利福平 0.6 g，每日1次；克拉霉素0.5 g，每日2次。1個(gè)月后傷口愈合良好，出院。

患者2：查體見手術(shù)切口瘢痕長(zhǎng)5 cm，紅腫，隆起，3個(gè)小傷口，流膿，膿液無(wú)臭味。傷口約9 cm深，很窄，僅容12號(hào)尿管通過，內(nèi)可刮出炎性肉芽組織。電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）結(jié)果示竇道深，范圍廣，近腰大肌及腎上腺手術(shù)區(qū)域（圖1）。剪開創(chuàng)面清創(chuàng)引流后，使用左氧氟沙星0.75 g，每日1次；利福平0.6 g，每日1次；克拉霉素0.5 g，每日2次。創(chuàng)口逐漸痊愈，6周后出院。

圖1 患者2 CT竇道造影

患者3：1個(gè)月前因左腰部傷口仍有血性滲出液流出，入院后CT結(jié)果見圖2。傷口分泌物培養(yǎng)結(jié)果為RGM，給予左氧氟沙星等抗感染治療1個(gè)月，無(wú)明顯改變。查體見左腰部前方一外口約0.5 cm竇道，深度約11 cm，負(fù)壓吸引可見棕褐色引流液，左腰部稍后方可見1處外口約1.5 cm潰瘍，深度約4 cm，無(wú)滲出，皮膚無(wú)紅腫，取引流液進(jìn)行培養(yǎng)，再次確認(rèn)生長(zhǎng)RGM。給予阿奇霉素0.5 g，每日1次；左氧氟沙星0.75 g，每日1次化療1個(gè)月后病情穩(wěn)定，帶藥出院。

圖2 患者3 CT竇道造影

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

患者1有疑似RGM菌落生長(zhǎng)，分純后取48 h生長(zhǎng)菌落進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為鼻疽分枝桿菌，基因測(cè)序結(jié)果亦為鼻疽分枝桿菌；患者2有疑似RGM菌落生長(zhǎng)，分純后取48 h生長(zhǎng)菌落進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為分枝桿菌屬，基因測(cè)序結(jié)果為偶發(fā)分枝桿菌，取信測(cè)序結(jié)果，鑒定為偶發(fā)分枝桿菌；患者3有疑似RGM菌落生長(zhǎng)，分純后取48 h生長(zhǎng)菌落進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為膿腫分枝桿菌，基因測(cè)序結(jié)果亦為膿腫分枝桿菌，鑒定為膿腫分枝桿菌。3株分純后的菌株生長(zhǎng)速度均較快，72 h生長(zhǎng)菌落形態(tài)見圖3。

圖3 鼻疽分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌培養(yǎng)72 h結(jié)果

2.3 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)M24-A2文件[9]上有折點(diǎn)的藥物（阿米卡星、亞胺培南、妥布霉素、頭孢西丁、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、利奈唑胺和克拉霉素）進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，此外還增加了醫(yī)院臨床常用的抗菌藥物，包括左氧氟沙星、利福平和阿奇霉素的最小抑菌濃度報(bào)告。3株細(xì)菌對(duì)阿米卡星、妥布霉素、亞胺培南和利奈唑胺均敏感，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑均耐藥。見表1。

表1 3株RGM體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究選取2010年至今北京大學(xué)第一醫(yī)院3例軟組織RGM感染病例，1例是外傷后慢性創(chuàng)口和淋巴結(jié)感染鼻疽分枝桿菌，2例是泌尿外科術(shù)后切口感染偶發(fā)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌形成深度超過10 cm的竇道。由于某些尚不清楚的原因，RGM感染病例基本都集中在北半球的發(fā)達(dá)國(guó)家，推測(cè)可能和診斷治療水平有關(guān)[10-11]。美國(guó)2007年發(fā)布的《診斷治療和預(yù)防非結(jié)核分枝桿菌指南》[11]可見，美國(guó)分離的RGM絕大部分都是肺部感染來源，只有3%的淋巴結(jié)感染和3%的軟組織感染來源。亞洲地區(qū)的病例情況也類似，肺部感染病例最多[1，10]。歐洲以慢速生長(zhǎng)的堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌等為主，亞洲，尤其是東亞，以RGM（偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群、龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群以及恥垢分枝桿菌復(fù)合群）感染病例為主[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道的軟組織感染爆發(fā)包括手術(shù)后感染、外傷感染和注射后膿腫等[12-14]。污染菌的來源為年久失修的供水管道系統(tǒng)，未消毒徹底的內(nèi)鏡或氣管鏡等[13]。在我國(guó)臺(tái)灣省北部一家醫(yī)療中心內(nèi)曾經(jīng)出現(xiàn)過RGM的爆發(fā)[15]。

很多R G M 感染與患者免疫抑制狀態(tài)有關(guān)[11-12]，但是開放性創(chuàng)傷后RGM感染也可發(fā)生于免疫正常者[11-12]。本研究的3個(gè)病例都不伴有造成免疫抑制狀態(tài)的基礎(chǔ)疾病，外傷或手術(shù)破壞了表皮組織的屏障作用是導(dǎo)致感染發(fā)生的先決條件。

本研究分離出的1株鼻疽分枝桿菌和1株偶發(fā)分枝桿菌都是偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群的成員，根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果[13，15]和診斷治療指南[11]，偶發(fā)分枝桿菌和恥垢分枝桿菌對(duì)于很多口服抗菌藥物都比較敏感，100%敏感的藥物包括左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和磺胺類，但是對(duì)頭孢西丁和多西環(huán)素只有50%的敏感可能性。治療時(shí)至少要采用2種藥物聯(lián)合。因?yàn)橹委煏r(shí)間往往長(zhǎng)達(dá)1年，藥物的選擇和患者的耐受性有關(guān)。對(duì)于嚴(yán)重的皮膚、骨骼、軟組織偶發(fā)分枝桿菌感染，最少應(yīng)采用2種藥物治療4個(gè)月，骨骼感染推薦治療6個(gè)月。對(duì)于較大范圍感染，膿腫形成，或藥物治療存在困難時(shí)應(yīng)采取手術(shù)方式。本研究病例普遍采取了切開引流的有創(chuàng)操作，或者去除導(dǎo)管或假體等感染源頭。本研究中第3個(gè)病例分離出的是膿腫分枝桿菌。膿腫分枝桿菌天然對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的抗結(jié)核治療藥物耐藥[16]，而且由于膿腫分枝桿菌種群內(nèi)部藥物敏感性的異質(zhì)性，分離出的每個(gè)菌株都推薦依照體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行藥物治療。雖然相關(guān)指南[11]認(rèn)為未經(jīng)治療的膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素100%敏感，但是2002年我國(guó)臺(tái)灣的研究結(jié)果顯示，膿腫分枝桿菌對(duì)克拉霉素的敏感率只有50%左右，對(duì)頭孢西丁和亞胺培南敏感率也較低[13，15]。對(duì)于皮膚軟組織感染，相關(guān)指南[1]推薦的治療方法是克拉霉素1 g/d，或阿奇霉素250 mg/d，合并使用胃腸外藥物（阿米卡星或頭孢西丁或亞胺培南）。敏感性最強(qiáng)的胃腸外藥物是阿米卡星，推薦療程和鼻疽分枝桿菌相同，都是最少4個(gè)月。必要時(shí)輔以外科手術(shù)[10]。最近的研究結(jié)果顯示，由于很多RGM菌株都含有一種紅霉素核糖體甲基化酶，這種酶可被緩慢誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此對(duì)于克拉霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)至14 d[17]。本研究7 d之后觀察，2株RGM的克拉霉素藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果都是中介，膿腫分枝桿菌結(jié)果是耐藥，提示大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物應(yīng)限制用于RGM的治療。

本研究中分鼻疽枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌感染病例都經(jīng)驗(yàn)采用左氧氟沙星+阿奇霉素+利福平的療法。雖然沒有可以依據(jù)的折點(diǎn)，但是通過最小抑菌濃度判斷，這2株RGM均對(duì)左氧氟沙星敏感，鼻疽分枝桿菌對(duì)阿奇霉素耐藥，偶發(fā)分枝對(duì)阿奇霉素敏感。本研究中3例患者治療效果均很好，2例患者經(jīng)手術(shù)清創(chuàng)引流，最后都痊愈出院。而從最小抑菌濃度分析，膿腫分枝桿菌對(duì)阿奇霉素敏感，左氧氟沙星的最小抑菌濃度較高，最后出院時(shí)也未做到完全痊愈。符合膿腫分枝桿菌治療較偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群困難的特點(diǎn)。

綜上所述，本研究中3株RGM的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[10-11，13-18]基本一致。RGM因較罕見，本研究結(jié)果可為臨床進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RGM，并有效治療RGM感染提供幫助。