顧 霞， 王凱玲， 芮莊華， 龍?；?， 陳國君， 任 濤

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科,上海 200123；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院血管外科，上海 200123)

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自體NK細(xì)胞過繼輸注對Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者天然免疫與體力狀態(tài)的影響

顧 霞1， 王凱玲1， 芮莊華1， 龍海虎1， 陳國君2， 任 濤1

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科,上海 200123；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院血管外科，上海 200123)

目的 研究自體NK細(xì)胞過繼輸注對晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)患者天然免疫及體力狀況(performance status， PS)評分的影響。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測20例晚期NSCLC患者(肺癌組)和20例健康人(健康對照組)外周血NK(CD16+CD56+)細(xì)胞的表達(dá)水平；檢測晚期NSCLC患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼輸注后外周血NK(CD16+CD56+)細(xì)胞的表達(dá)水平。根據(jù)美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體力狀況評分標(biāo)準(zhǔn)，比較肺癌組患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼輸注前后PS評分的變化情況。結(jié)果 外周血NK(CD16+CD56+)細(xì)胞的表達(dá)明顯降低[(8.980±1.942)%]，與健康對照組[(15.290±1.869)%]比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肺癌組治療前PS評分為(1.50±1.080)，應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼輸注后PS評分顯著降低(1.00±0.816)，外周血NK(CD16+CD56+)細(xì)胞的表達(dá)顯著升高[(24.660±10.049)%]，與治療前比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 自體NK細(xì)胞過繼免疫治療有助于提高晚期NSCLC患者的免疫功能狀態(tài)及體力狀況。

非小細(xì)胞肺癌腫瘤； 自體細(xì)胞過繼免疫治療； 流式細(xì)胞術(shù)； 外周血； NK細(xì)胞； 體力狀況評分

世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2014年世界癌癥報告》指出肺癌是目前全球發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，亦是我國死亡率上升最高的腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)占肺癌總病例數(shù)的75%～85%。NSCLC的臨床治療除了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療和靶向治療以外，免疫治療也愈加成為一個重要的治療手段。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮了重要的作用，涉及多種免疫細(xì)胞及其分泌的產(chǎn)物。自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要成員，其不需要抗原預(yù)先致敏，不依賴抗體與補體，也無組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex， MHC)限制性，能快速、直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體腫瘤免疫中的第一道防線[2]。過繼免疫細(xì)胞治療是指先將體外激活的自體或異體免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和功能鑒定，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞[3-5]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞在NSCLC患者中的表達(dá)水平及其在晚期NSCLC患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療前后的表達(dá)的變化，并探討其臨床意義。同時本研究根據(jù)美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group， ECOG)體力狀況評分標(biāo)準(zhǔn)，比較NSCLC患者應(yīng)用過繼NK細(xì)胞免疫治療前后PS評分的變化情況，以評價自體NK細(xì)胞過繼免疫治療對肺癌患者體力狀況的改善情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院2015年6月至2015年12月間住院收治的進(jìn)行NK細(xì)胞免疫治療的Ⅲ-Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者20例，診斷及分期均參照《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015版)》標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)病理學(xué)確診為腺癌或鱗癌，進(jìn)行過化療或服用靶向藥物，治療前均處于穩(wěn)定期，預(yù)計存活期超過3個月，PS評分均≤3分。其中女性10例，男性10例；年齡36～74歲，平均年齡(59.5±11.0)歲；腺癌12例，鱗癌8例。同時收集2015年6月至2015年12月我院體檢中心健康體檢者20例為對照組，其中女8例，男12例，年齡38～76歲，平均年齡(58.2±12.4)歲。兩組在性別、年齡等一般資料對比上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病理類型以及臨床分期者；無可測量病灶或病灶不能評估者；合并免疫系統(tǒng)疾病或使用過免疫抑制劑者；合并其他嚴(yán)重疾病、功能障礙或惡性腫瘤者；處于妊娠期或哺乳期的患者；依從性差的患者；精神障礙、意識障礙或語言障礙者。

1.3 終止標(biāo)準(zhǔn)

有影像學(xué)證實疾病進(jìn)展；患者產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)或死亡；患者要求停止或不能依從；患者失訪(如患者移居他地、轉(zhuǎn)院、時間或計劃限制)。

1.4 方法

肺癌組給予NK細(xì)胞過繼免疫治療，每個療程3d，第一個療程前1d及第二個療程前1d行外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平檢測，并根據(jù)ECOG標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PS評分。該免疫治療方案經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.5 外周血NK細(xì)胞檢測

采集所有研究對象外周靜脈血2～3ml置于EDTA-K2抗凝管中，從管中取出100μl全血與10μl FITC標(biāo)記的CD3抗體(美國BD Bioscience公司)及PE標(biāo)記的抗CD16+56+抗體(美國BD Bioscience公司)充分混勻，在室溫下避光孵育20min。在管中加入3ml紅細(xì)胞裂解液，充分混勻后繼續(xù)在室溫下避光裂解20min。1500r/min，離心半徑15cm，離心5min，倒去上清液，再加入3ml PBS，重復(fù)上述離心后倒去上清液，管中剩下單個核細(xì)胞，加入2ml生理鹽水，混勻后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(FACs CaliburTM流式細(xì)胞儀購自Becton Dickinson公司)，計數(shù)5000個細(xì)胞后停止，讀出CD3-/CD16+CD56+的百分比。

1.6 體力狀況評分標(biāo)準(zhǔn)

采取ECOG體力狀況評分標(biāo)準(zhǔn)。0分： 活動能力完全正常，與起病前活動能力無任何差異；1分： 能自由走動及從事輕體力活動，包括一般家務(wù)或辦公室工作，但不能從事較重的體力活動；2分： 能自由走動及生活自理，但已喪失工作能力，日間不少于一半時間可以起床活動；3分： 生活僅能部分自理，日間一半以上時間臥床或坐輪椅；4分： 臥床不起，生活不能自理；5分： 死亡。

1.7 NK細(xì)胞的制備及回輸

1.7.1 NK細(xì)胞制備及回輸過程 抽取肺癌組患者外周50ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)，計數(shù)后在含有IL-2、血清等的培養(yǎng)基及刺激因子包被的75cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。第3～4天將細(xì)胞移入175cm2培養(yǎng)瓶中，并補充新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第7～8天將細(xì)胞移入培養(yǎng)袋中，補充新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第12～14天后取少許培養(yǎng)的NK細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，當(dāng)CD3-CD16+CD56+細(xì)胞數(shù)≥25%時，且細(xì)菌、真菌及支原體培養(yǎng)均為陰性時收集細(xì)胞并計數(shù)，加入1%人血白蛋白生理鹽水中分3次回輸，輸注的細(xì)胞總數(shù)大于3×109。

1.7.2 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞制備過程質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)如下。(1) 細(xì)菌、霉菌檢測： 采用血平皿法，結(jié)果陰性方可進(jìn)行下一步操作。(2) 每次細(xì)胞操作均進(jìn)行檢菌實驗。(3) 每次回輸前24～48h進(jìn)行檢菌實驗。細(xì)胞制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)如下。(1) 細(xì)菌、霉菌檢測： 采用血平皿法，在細(xì)胞回收后進(jìn)行，取2份樣本，一份實驗室自檢，一份-80℃存檔。(2) 內(nèi)毒素檢測： 采用鱟試劑方法，在細(xì)胞回收的當(dāng)天進(jìn)行，取末次洗滌液檢測，結(jié)果≤0.25EU方可進(jìn)行細(xì)胞回輸。(3) 細(xì)胞表型檢測： 在細(xì)胞回收前24h進(jìn)行，以便在回收的當(dāng)天提供檢驗報告。(4) 細(xì)胞活性檢測： 在細(xì)胞回收當(dāng)天進(jìn)行，活性≥90%的細(xì)胞方可回輸。(5) 細(xì)胞計數(shù)： 細(xì)胞數(shù)在3×109以上方可回輸。

1.7.3 NK細(xì)胞回輸后不良反應(yīng) 輸入NK細(xì)胞過程中僅有1例患者出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，體溫≤38.5℃，對癥處理后很快降至正常，未影響治療。所有入組患者未見過敏反應(yīng)、肝腎功能異常及其他系統(tǒng)不良癥狀。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同人群組外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平

肺癌組的外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平為(8.980±1.9424)%，健康對照組外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平為(15.290±1.8687)%，肺癌組NK細(xì)胞(CD16+CD56+)數(shù)量與健康對照組相比明顯減少(P<0.01)。

2.2 肺癌組患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療前后外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平變化

肺癌組應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療前外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平為(8.980±1.9424)%，應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療1個療程后的外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平為(24.660±10.0487)%，與應(yīng)用該治療前比較，NK細(xì)胞(CD16+CD56+)的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。其中鱗癌患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療前后外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平的差值為(15.975±13.8126)%，而腺癌患者此差值為(15.483±8.2659)%，二者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示治療前后外周血NK細(xì)胞表達(dá)水平變化情況與肺癌病理類型無關(guān)。

2.3 肺癌組患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療前后PS評分變化

肺癌組患者應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療前PS評分為(1.50±1.080)，而應(yīng)用自體NK細(xì)胞過繼免疫治療后PS評分為(1.00±0.816)，與治療前相比顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

自體細(xì)胞過繼免疫治療是指先將體外激活的自體免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和功能鑒定，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。其優(yōu)勢在于免疫細(xì)胞經(jīng)體外處理可避免患者體內(nèi)腫瘤免疫障礙的多種機(jī)制，大量擴(kuò)增具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，同時亦可避免體內(nèi)大量輸入細(xì)胞因子引起的嚴(yán)重毒副作用。本研究所采用的擴(kuò)增方法雖然技術(shù)要求高、難度大，但其適用性高，使NK細(xì)胞數(shù)量級由106增長到109，達(dá)到臨床應(yīng)用要求，且未見明顯不良反應(yīng)，生物安全性高。

NK細(xì)胞是不同于T、B淋巴細(xì)胞的第三類淋巴細(xì)胞，它們來源于骨髓的大顆粒細(xì)胞，在體內(nèi)數(shù)量相對較少，廣泛分布于骨髓、外周血、骨髓、脾臟及其他淋巴器官，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要成員，它不需要抗原預(yù)先致敏即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞[6]，且這種殺傷能力無MHC限制，其細(xì)胞表面標(biāo)志主要是CD16和CD56[7-8]。因此與腫瘤標(biāo)記物等常規(guī)指標(biāo)相比，研究肺癌患者外周血NK細(xì)胞表達(dá)情況有助于評估患者的免疫狀態(tài)及預(yù)后，為肺癌的自體細(xì)胞過繼免疫治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外周血NK細(xì)胞(CD16+CD56+)的表達(dá)較健康人顯著減少，這可能與肺癌患者機(jī)體免疫功能紊亂、免疫力下降相關(guān)[9]。晚期NSCLC患者在應(yīng)用NK細(xì)胞過繼免疫治療后其外周血NK細(xì)胞(CD16+CD56+)表達(dá)增加，但與肺癌類型無關(guān)，且PS評分顯著降低，該組患者在應(yīng)用治療1個月后復(fù)查腫瘤均無復(fù)發(fā)。這提示自體NK細(xì)胞過繼免疫治療有助于提高晚期非小細(xì)胞肺癌患者的免疫功能狀態(tài)及體力狀況，從而提高機(jī)體的抗腫瘤免疫作用及患者生活質(zhì)量。

NK細(xì)胞可應(yīng)用于過繼免疫細(xì)胞治療，它的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制有： (1) NK細(xì)胞直接通過胞吐作用釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性顆粒，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶相關(guān)信號通路誘導(dǎo)腫瘤靶細(xì)胞凋亡和破壞胞內(nèi)結(jié)構(gòu)[10-11]。(2) 活化的NK細(xì)胞表達(dá)TNF-α配體，與腫瘤靶細(xì)胞膜表面腫瘤壞死因子受體(TNFR)-1結(jié)合，啟動腫瘤細(xì)胞凋亡信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。(3) 活化的NK細(xì)胞表達(dá)Fas(CD95)配體，與腫瘤靶細(xì)胞膜表面上受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。(4) NK細(xì)胞膜表面表達(dá)的CD16與腫瘤特異性抗體結(jié)合，通過ADCC效應(yīng)識別殺傷與該抗體特異性結(jié)合的腫瘤細(xì)胞[14]。目前有多項研究結(jié)果顯示，肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等患者經(jīng)NK細(xì)胞過繼免疫治療后有良好的治療效果[15-16]。但是過繼細(xì)胞治療也存在一定的局限性： (1) 免疫細(xì)胞體外培養(yǎng)的費用較高，且過程中也存在個體差異性，因此很難批量生產(chǎn)。(2) 免疫反應(yīng)的評估需要較長的時間，而且細(xì)胞的數(shù)目需要達(dá)到一定量。(3) 免疫細(xì)胞的制備過程復(fù)雜，要求條件高，限制了一些患者(如免疫系統(tǒng)疾病)使用此方法治療疾病。因為這些局限性使得本研究在半年內(nèi)入選的病例數(shù)較少，且ECOG評分的依據(jù)僅僅是腫瘤患者的活動能力，存在一定的主觀性，評分的高低不一定能表達(dá)腫瘤的進(jìn)展，也不是腫瘤的臨床分級，因此可能存在一定的偏差。

肺癌的發(fā)生發(fā)展與患者的免疫功能的缺陷密切相關(guān)，因此相較于肺癌的傳統(tǒng)治療方法而言，過繼細(xì)胞治療的特點是特異性強、副作用小。近年來腫瘤的過繼細(xì)胞治療的發(fā)展迅速，顯示了良好的應(yīng)用前景，但缺乏大樣本的多中心的臨床數(shù)據(jù)，而且僅僅以腫瘤演進(jìn)中的一個環(huán)節(jié)作為治療的內(nèi)容，很難徹底治愈惡性腫瘤，因此還需將多種免疫治療方法有機(jī)地結(jié)合起來，并通過與手術(shù)、化療、放療、靶向藥物治療等治療手段相結(jié)合以增強過繼細(xì)胞治療的效果。我們相信隨著對NK細(xì)胞的深入研究，更加完善的NK細(xì)胞培養(yǎng)方法的創(chuàng)建，更多臨床高級別數(shù)據(jù)的佐證，NK細(xì)胞過繼免疫治療會有進(jìn)一步的突破，為肺癌患者來帶新的希望。

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Immune function and performance score of patients with stage Ⅲ-Ⅳ non-small cell lung cancer patients before and after the adoptive transfer of autologous NK cells

GUXia1，WANGKai-ling1，RUIZhuang-hua1，LONGHai-hu1，CHENGuo-jun2，RENTao1

(1. Dept. of Respiratory， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200123， China； 2. Dept. of Vascular Surgery， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200123， China)

Objective To investigate the immune function and performance score of patients with advanced non-small cell lung cancer(NSCLC) before and after adoptive transfer of autologous NK cells. Methods Twenty patients with stage Ⅲ-Ⅳ NSCLC(Lung cancer group) undergoing adaptive autologous NK cells and 20 healthy subjects(control group) were enrolled in the study. Peripheral blood NK cells(CD16+CD56+)were detected with flow cytometry, and the Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG) performance scores(PS) were evaluated before and after the adoptive NK therapy. Results Before adaptive therapy the peripheral blood NK(CD16+CD56+)levels in NSCLC patients were significantly lower than those in controls [(8.980±1.942)%vs(15.290±1.869)%,P<0.05]. The PS was decreased from(1.50±1.080) to(1.00±0.816)(P<0.05); and the peripheral blood NK levels was increased to(24.660±10.049)%] after adoptive therapy(P<0.05). Conclusion Autologous NK cells adoptive immunotherapy may improve the immune function and performance status in patients with advanced non-small cell lung cancer.

non-small cell lung cancer； autologous cells adoptive immunotherapy； flow cytometry； peripheral blood； NK cells； performance status score

10.16118/j.1008-0392.2016.04.014

2016-04-07

上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人計劃(16XD1403100);浦東新區(qū)重點學(xué)科(PWZx2014-10)

顧 霞(1981—)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生.E-mail: amethystguxia@126.com

任 濤.E-mail: rentao305@163.com

R 734.2

A

1008-0392(2016)04-0070-04