李永平，林 琿，康建坂,溫慶放*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013)

辣椒EST-SSR 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證

李永平1，2，林 琿1，2，康建坂1，2,溫慶放1，2*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013)

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載118 900條辣椒相關(guān)EST，對(duì)其進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共搜索出3 343條SSR，分布密度為1/17.20 kb，共有287種重復(fù)基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸(1 476個(gè)SSR)和六核苷酸(1 128個(gè)SSR)占主導(dǎo)地位，所占比例分別為44.15%和33.74%；出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是GA/TC，占總數(shù)的14.30%，其次為CT/AG(94 個(gè)，占8.11%)。針對(duì)3 343條含有SSR的EST 設(shè)計(jì)合成了200對(duì)引物。用17份辣椒種質(zhì)對(duì)200對(duì)引物進(jìn)行篩選，196對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，71對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，共有220個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。利用71對(duì)多態(tài)性引物，對(duì)特定親本P181-2-6和P230-2-5及其雜種一代F1的親緣關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果說(shuō)明從辣椒相關(guān)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中開(kāi)發(fā)的SSR引物有較好的可用性。

辣椒；EST-SSR；標(biāo)記開(kāi)發(fā)；指紋圖譜

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記技術(shù)因多態(tài)性高、靈敏度高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、分析簡(jiǎn)便、共顯性和特異性等特點(diǎn)[1]，自1989年建立以來(lái)，已被廣泛用于遺傳圖譜繪制[2]、重要農(nóng)藝性狀的基因定位[3-4]、生物遺傳多樣性[5]、品種鑒定[6]等諸多方面。

近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，各種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)迅速增加。EST-SSR 因來(lái)自基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)與功能基因有緊密的連鎖，且在物種間有較高的通用性，其開(kāi)發(fā)與應(yīng)用已在小麥[7]、棉花[8]、大豆[9]、花生[10]等大田作物中均有報(bào)道，EST-SSR標(biāo)記在一些主要蔬菜作物中也有一定的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，如番茄[11]、黃瓜[12]、油菜[13]、大白菜[14]、甘藍(lán)[15]和蘿卜[16]。辣椒的EST-SSR標(biāo)記也有研究，但已公開(kāi)報(bào)道可利用的SSR標(biāo)記僅有500多個(gè)[17-23]，開(kāi)發(fā)標(biāo)記數(shù)量明顯偏少，遠(yuǎn)不能滿足辣椒分子育種研究的需要。本研究利用NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)報(bào)道的近12萬(wàn)條辣椒相關(guān)EST，開(kāi)發(fā)EST-SSR 標(biāo)記并分析其多態(tài)性，為辣椒的種質(zhì)資源分析、指紋圖譜、遺傳作圖和分子標(biāo)記輔助育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和模板DNA 的提取

以17份辣椒種質(zhì)、早熟牛角椒P181-2-6和抗TY的P230-2-5兩份辣椒自交系及其雜交后代F1(表1)為引物篩選材料，檢測(cè)引物的擴(kuò)增與多態(tài)性。所有試驗(yàn)材料均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心所提供，于2015年春季種植于本所試驗(yàn)田，在定植緩苗后苗期取幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。

1.2 辣椒EST 來(lái)源、EST-SSR 的發(fā)掘及分析

辣椒相關(guān)EST 來(lái)自NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)，共計(jì)118 900條(截至2015年8月)。利用SSRHumter分析軟件對(duì)下載的EST序列進(jìn)行SSR搜索。SSR篩選標(biāo)準(zhǔn)為：二、三、四、五和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為9、7、5、4、3次以上，所有重復(fù)類型的總核苷酸數(shù)不能少于18個(gè)。

EST-SSR的出現(xiàn)頻率(%)=(檢出的SSR個(gè)數(shù)/EST 總數(shù))×100%；EST-SSR平均分布距離 = EST 總長(zhǎng)度/SSR個(gè)數(shù)。優(yōu)勢(shì)基元中SSR出現(xiàn)頻率(%)=(優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元SSR數(shù)量/優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元SSR總數(shù)量)×100%。

1.3 EST-SSR的引物設(shè)計(jì)與合成

利用primer premier 5.0軟件對(duì)含有SSR的EST設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)：引物長(zhǎng)度控制在15～30 bp，預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在150～350 bp；引物3′端不出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，引物的3′端避免使用堿基A；引物序列的GC含量選擇在40%～60%；Tm值50～60℃；引物分值90以上。選擇以不同主導(dǎo)重復(fù)基元類型設(shè)計(jì)的EST-SSR引物200對(duì)，由福州博尚生物技術(shù)有限合成。

1.4 引物有效性檢測(cè)

利用17 份辣椒種質(zhì)、早熟牛角椒P181-2-6和抗TY的P230-2-5兩份辣椒自交系及其雜交后代F1 對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行檢驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，50 ng模板DNA，0.3 μmol·L-1引物，0.5 mmol·L-1dNTP，1.0 UTaqDNA聚合酶，2.0 mmol·L-1MgCl2，2.0 μL10×PCR緩沖液，加入滅菌的超純水至20 μL。所用試劑均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件是：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 變性45 s，50℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，90 V穩(wěn)壓電泳1 h，EB染色，在UVP公司的GDS8000凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，每塊膠板均由2人獨(dú)立記錄，然后比對(duì)，有爭(zhēng)議的數(shù)據(jù)作缺失處理。

表1 17 份辣椒種質(zhì)及特定親本和后代Table 1 Seventeen typical C. annuum germplasms and specific parents and F1 hybrids

1.5 種質(zhì)親緣關(guān)系分析

基于17份辣椒種質(zhì)DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，有帶擴(kuò)增記為1，無(wú)帶記為0，利用NTSYSpc2.0對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒EST-SSR信息分析

2.1.1 辣椒EST的基本信息及EST-SSR 頻率和密度 從NCBI下載118 900 條辣椒EST，經(jīng)搜索共挖掘到3 343 個(gè)SSR，發(fā)生頻率2.82%，平均分布距離為17.2 kb。結(jié)果(表2)表明，辣椒具有豐富的EST-SSR 類型，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類型都有出現(xiàn)，但不同核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)的頻率相差較多。核苷酸重復(fù)類型以二核苷酸重復(fù)與六核苷酸重復(fù)為主，二者占總SSR 比例的77.89%，其中二核苷酸重復(fù)中的SSR 數(shù)量最多，占總SSR比例的44.15%，其次是六核苷酸重復(fù)重復(fù)較多，比例為33.74%。

搜索共觀察到287種重復(fù)基元，六核苷酸重復(fù)中出現(xiàn)最多的重復(fù)基元達(dá)182 種，占基元種數(shù)的63.41%。二核苷酸10 種，三核苷酸36 種，四核苷酸22 種，五核苷酸37 種。

辣椒EST中平均每17.2 kb 出現(xiàn)一個(gè)SSR，不同重復(fù)類型的SSR覆蓋的平均距離差異較大，SSR數(shù)越多其覆蓋的平均距離越小(表2)。

表2 辣椒 EST 中SSR 出現(xiàn)頻率Table 2 Occurrence of SSRs in ESTs of C. annuum

2.1.2 辣椒EST-SSR 重復(fù)基元類型和比例 各種不同重復(fù)基元中出現(xiàn)最多的是二核苷酸重復(fù)類型GA/TC，占總SSR 的比例為18.37%，其次是AG/CT，比例為12.83%。二核苷酸中，以GA/TC重復(fù)基元占優(yōu)，占41.60%，GA/TC、AG/CT、AT/TA三者占93.03%，但CG/GC 重復(fù)基元沒(méi)有出現(xiàn)；三核苷酸中，各重復(fù)基元分布較為均衡；四核苷酸中，以TAAT/ATTA重復(fù)基元為主，占36.08%；五核苷酸中，重復(fù)基元主要為ATATA/TATAT，比例為49.69%；六核苷酸中，以TCATGG/CCATGA重復(fù)基元類型為主，占比例10.28%。

2.1.3 辣椒EST-SSR重復(fù)基元長(zhǎng)度 辣椒辣椒EST-SSR二至六核苷酸平均基元長(zhǎng)度變化范圍差異很大，二核苷酸的長(zhǎng)度變化范圍最大，為18～152 bp，五核苷酸長(zhǎng)度范圍最小為20～30 bp；從平均長(zhǎng)度看，二核苷酸最長(zhǎng)達(dá)43.82 bp，其次是三核苷酸25.09 bp、四核苷酸21.86 bp、五核苷酸的20.57 bp、六核苷酸18.10 bp(表4)。

2.2 辣椒EST-SSRs 引物有效性驗(yàn)證

2.2.1 EST-SSRs 標(biāo)記在17份辣椒種質(zhì)中的多態(tài)性 選擇了不同重復(fù)類型和重復(fù)次數(shù)的EST-SSRs 設(shè)計(jì)合成了一批引物。其中具二苷酸重復(fù)的引物50 對(duì)，三核苷酸重復(fù)引物49對(duì)，四核苷酸重復(fù)引物10 對(duì)，五核苷酸重復(fù)引物11 對(duì)，六核苷酸重復(fù)引物80對(duì)并以17 份辣椒種質(zhì)的基因組DNA為模板對(duì)合成的200 對(duì)引物進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，能清晰擴(kuò)增產(chǎn)物的引物有196 對(duì)，擴(kuò)增有效率為98.00%；其中71 對(duì)EST-SSR引物具有多態(tài)性，共擴(kuò)增出220 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每個(gè)引物產(chǎn)生3.1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。由表5可以初步看出，不同核苷酸重復(fù)引物的擴(kuò)增有效率和多態(tài)性比例不同，以二核苷酸重復(fù)開(kāi)發(fā)出的引物，多態(tài)性比例最高，為46.00%，而基于五核苷酸重復(fù)開(kāi)發(fā)的引物多態(tài)性比例最低為9.10%。在基元重復(fù)數(shù)量最多(表3)的二核苷酸、六核苷酸開(kāi)發(fā)引物的效率較高。

表3 辣椒EST-SSR優(yōu)勢(shì)基元重復(fù)類型Table 3 Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum

表4 辣椒EST-SSR 基元重復(fù)長(zhǎng)度Table 4 Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum

表5 不同核苷酸重復(fù)引物的擴(kuò)增有效率和多態(tài)性比例Table 5 Proportions of effective and polymorphic primers for different types of motifs

在17份辣椒種質(zhì)擴(kuò)增中不同引物擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量不同。部分引物對(duì)17份辣椒種質(zhì)基因組DNA的擴(kuò)增，顯示較豐富多態(tài)性(圖1、2)。

2.2.2 EST-SSRs標(biāo)記在特定材料中的共顯性 用具有多態(tài)性的71 對(duì)引物，對(duì)親本P181-2-6 和P230-2-5 及其雜種一代F1 的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在這一特定親本間仍具有多態(tài)性的引物43 對(duì)，其中在親本及其F1 中呈共顯性的標(biāo)記共有27 對(duì)(圖3-A)，顯偏母型的有9 對(duì)(圖3-B)，偏父型的有7 對(duì)(圖3-C)。從多態(tài)性和顯性、共顯性來(lái)看，基于EST序列開(kāi)發(fā)辣椒SSR引物是可行和有效的，這些標(biāo)記可用于辣椒遺傳多樣性分析、指紋圖譜、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及分子標(biāo)記輔助育種等方面。

2.3 EST-SSR 標(biāo)記在辣椒種質(zhì)遺傳關(guān)系分析中的應(yīng)用

以71 對(duì)多態(tài)性引物對(duì)17 份辣椒種質(zhì)進(jìn)行聚類分類(圖4)，在相似系數(shù)0.64 處可將其分為5大類。PA001、PA002、PA003、PA004聚為一類，均為黃椒類型，PA006、PA010、PA014、PA013、 PA015、PA011、PA016、PA017、PA012均為牛角椒類型，PA009為羊角椒，PA005、PA008為朝天椒，PA007為野生椒。結(jié)果表明開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記能很好地將辣椒親緣關(guān)系鑒別出來(lái)。

3 討 論

本研究基于從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的118 900條辣椒EST，進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共得到3 343 條SSR，發(fā)生頻率2.82%，分布密度為1/17.20 kb，包括287 種重復(fù)基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸(1 476 個(gè)SSR)和六核苷酸(1 128 個(gè)SSR)占主導(dǎo)地位，所占比例分別為44.15%和33.74%；出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是GA/TC，占總數(shù)的 14.30%，其次為CT/AG(94 個(gè)，占8.11%)。支莉等[23]2010年從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得116 952條辣椒ESTs序列，發(fā)現(xiàn)1 736個(gè)微衛(wèi)星，EST-SSRs序列出現(xiàn)頻率為1.92%。在辣椒EST-SSRs中，二核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最高，占總SSR的56.4%，其次是三核苷酸重復(fù)類型，占總SSR的23.3%。共檢測(cè)到149種基序重復(fù)類型，重復(fù)基序出現(xiàn)頻率最高的為GA/TC，AG/CT次之。吳智明等[24]2012年通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中32 295 條非冗余的辣椒EST序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)3 396 個(gè)SSR位點(diǎn)，EST-SSR頻率為10.52%，平均分布距離為4.46 kb。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元占主導(dǎo)地位，分別占總SSR的43.02% 和37.84%。優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元為GA/TC、AG/CT和AT，分別占15.99%、11.98%和l1.37%。不同研究者研究的結(jié)果不盡相同，可能搜索軟件、搜索的核苷酸重復(fù)類型的長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定不同有關(guān)。現(xiàn)行的SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)中有12、15、18 bp 3 種重復(fù)基元總長(zhǎng)度。不同的研究者采用不同的搜索標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致結(jié)果不同。根據(jù)Schl?tterer等[25]的研究，SSR的變異頻率與基元重復(fù)數(shù)呈正相關(guān)，即重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)越多則SSR的多態(tài)性潛能越大。在本研究中采用了18 bp的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行SSR位點(diǎn)的篩選。目前EST-SSR位點(diǎn)搜索軟件如SSRIT、SSRhunt、MIAS、SSRfinder等，本研究用SSRhunt軟件，能準(zhǔn)確得到EST序列中總SSR位點(diǎn)和重復(fù)基元的數(shù)量，重復(fù)次數(shù)及位點(diǎn)位置，為進(jìn)一步了解辣椒EST-SSR位點(diǎn)信息和以后的引物設(shè)計(jì)提供了方便。

本研究中六核苷酸重復(fù)1 128 個(gè)SSR，占33.74%，以 TCATGG/CCATGA、ACGAGA/TGCTCT和CTGCTC/GAGCAG 3種重復(fù)基元為主，占六核苷酸重復(fù)基元總比例的24.03%。與前人的研究結(jié)果不同。在大多作物中，六核苷酸重復(fù)基元類型均不常見(jiàn)，僅在甘薯[26]、玉米[27]和蘿卜[16]中見(jiàn)到報(bào)道，這些可能與物種本身的基因組或轉(zhuǎn)錄組序列差異性有關(guān)。從設(shè)計(jì)合成了引物的多態(tài)性來(lái)看，基于六核苷酸重復(fù)基元設(shè)計(jì)的引物多態(tài)性達(dá) 33.75%，有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

雖然一般認(rèn)為，由于基因編碼序列的保守性等原因?qū)е?EST-SSR 揭示種間多態(tài)性低于源于基因組的 SSR 標(biāo)記。但是，17 份辣椒種質(zhì)對(duì)開(kāi)發(fā)引物鑒定結(jié)果，多態(tài)性達(dá)35.5%，在特定組合中的共顯性標(biāo)記比例為62.79%。本研究基于辣椒EST-SSR信息分析和標(biāo)記開(kāi)發(fā)是有效可行的，可用于辣椒遺傳多樣性分析、指紋圖譜、遺傳圖譜構(gòu)建等。

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(責(zé)任編輯：柯文輝)

Development and Utility of EST-SSR Marker inCapsicumannuumL.

LI Yong-ping1,2，LIN Hui1，2，KANG Jian-ban1,2，WEN Qing-fang1,2*

(1.VegetableResearchCenter，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350013，China；2.CropsResearchInstitute，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350013，China)

A total of 118,900 ESTs inCapsicumannuumL were downloaded from NCBI for identifying and developing an SSR marker. As a result, 3,343 SSRs in the ESTs with an average of one SSR per 17.20 kb were found, including 283 SSR motifs. Analysis on the SSR motifs revealed that they were mostly di-nucleotides (1,476 SSR) and hexa-nucleotides (1,128 SSR), accounting for 44.15% and 33.74% of the total, respectively. GA/TC was the most frequently found motifs (14.30% of all), which was followed by CT/AG (94 SSR, and 8.11% of all). From the 3,343 SSR-containing ESTs, 200 primer pairs were designed and validated for amplification using 17 pepper inbred lines. The results showed that 71 primer pairs yielded 220 amplification bands. Using those 71 pairs of polymorphic primers, the genetic relationship between the parents, P181-2-6 and P230-2-5, and their F1 hybrid was determined. It appeared that the SSR markers identified from the ESTs ofC.annuumwere potentially of practical applicatios.

CapsicumannuumL.; EST-SSR; marker development; fingerprinting

2016-07-11初稿；2016-09-23修改稿

李永平(1974-)，女，副研究員，研究方向：蔬菜分子育種(E-mail：248937256@qq.com) *通訊作者：溫慶放(1965-)，男，研究員，研究方向：蔬菜育種(E-mail：fjvrc@163.com)

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J01115)；福建省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)(2013NZ0002-3)

S 641.3

：A

：1008-0384(2016)11-1187-06

李永平，林琿，康建坂，等.辣椒EST-SSR 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(11)：1187-1192.

LI Y-P，LIN H，KANG J-B，et al.Development and Utility of EST-SSR Marker inCapsicumannuumL.[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1187-1192.