吳 斌，樊海平，王雪妹，黃小紅，張新艷，葉小軍，林志鏗

(1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002；2.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002；4.廈門快診生物科技有限公司，福建 廈門 361006)

鰻弧菌單克隆抗體-膠體金檢測方法的建立

吳 斌1，2，樊海平1*，王雪妹3，黃小紅3，張新艷1，葉小軍1，林志鏗4

(1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002；2.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002；4.廈門快診生物科技有限公司，福建 廈門 361006)

以滅活鰻弧菌(SMW5)全菌為抗原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，制備了鰻弧菌單克隆抗體3株，分別命名為1H9、1C12、6F8，細(xì)胞亞類分別為IgG2a、IgM、IgG2b，其中1H9腹水效價為1∶6.4×105。制備鰻弧菌(SMW5)兔多克隆抗體，效價為1∶3.2×105。應(yīng)用納米膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體1H9并制備金標(biāo)墊，抗鰻弧菌(SMW5)兔多克隆抗體與羊抗鼠抗體作為捕獲抗體包被硝酸纖維素膜，分別作為檢測線T和質(zhì)控線C,建立鰻弧菌的膠體金免疫層析快速檢測方法。經(jīng)過對試紙條的特異性和靈敏度測定，結(jié)果表明：試紙條與嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌，7種水產(chǎn)常見病原菌沒有交叉反應(yīng)，與鰻弧菌特異性反應(yīng)，檢測靈敏度為6.3×104cfu·mL-1，檢測所需時間低于10 min。所制備的鰻弧菌膠體金免疫層析檢測試紙條具有快速、簡便、特異性高和適應(yīng)基層生產(chǎn)推廣應(yīng)用等優(yōu)點。

鰻弧菌；單克隆抗體；多克隆抗體；膠體金；免疫層析

鰻弧菌Vibrioanguillarum最早分離自歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[1]，可導(dǎo)致多種海水養(yǎng)殖魚類的出血性敗血癥[2]，如歐洲鰻鱺、牙鲆Paralichthysolivaceus、大菱鲆Scophthalmusmaximus、花鱸Lateolabraxmaculatus、鱸魚Lateolabraxjaponicus、大黃魚Larimichthyscrocea及凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei等[3-9]。鰻弧菌病發(fā)病迅速、死亡率高和流行范圍廣，對水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[10]。

夏永娟[11]以鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株為抗原，制備了8株能穩(wěn)定分泌抗鰻弧菌單克隆抗體，其中2株特異性較強，并應(yīng)用于鰻弧菌檢測方法的建立；余俊紅等[12]從患病花鱸體內(nèi)分離到鰻弧菌W-1，制備兔抗血清，建立了檢測鰻弧菌的間接ELISA快速檢測法，檢測靈敏度為105個·mL-1，且具有較高的特異性，同時還建立檢測鰻弧菌的間接熒光抗體快速檢測技術(shù)[13]；鄒玉霞[14]以大菱鲆出血癥的致病菌-鰻弧菌SMP1為抗原制備兔抗血清，建立了在大菱鲆肝腎組織中檢測SMP1的間接ELISA方法，腎臟的陽性檢出率為87.7%,肝臟的陽性檢出率為90%；邊慧慧等[15]建立了抗鰻弧菌抗體效價雙抗原夾心ELISA檢測法，其靈敏度比凝集法高8～16倍。

病原菌膠體金免疫層析快速檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、高通量、便捷、價廉等優(yōu)點，本研究擬以制備的鰻弧菌單克隆抗體和兔多克隆抗體，研制鰻弧菌建立膠體金快速檢測試紙條，為水生動物鰻弧菌病的現(xiàn)場檢測提供快捷的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

鰻弧菌V.anguillarum(SMW5、參考株、1H00003)、溶藻弧菌V.alginolyticus(Js60517NA1)、創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus(FJ04-L1)、副溶血弧菌V.parahaemolyticus(ATCC17802)、哈維氏弧菌V.harveyi(03152)、河流弧菌V.fluvialis(參考株)、非0-1群霍亂弧菌V.chleraenon0-1diarrhea(96-2)、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila(ML316、JS01-1)、溫和氣單胞菌A.sobria(Fp60325NA)、豚鼠氣單胞菌A.caviae(AB40511NA1)、遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda(AL60306NA1)、類志賀鄰單胞Plesiomonsshigelloides(LCCi190625)和無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae(070717LL)均由福建省淡水水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動物病害防治研究室保藏。

1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)購自北京陸橋有限公司；羊抗鼠HRP-IgG為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；HT、8-氮鳥嘌呤、美洲胎牛血清、融合劑PET3500為美國Sima公司產(chǎn)品；單克隆抗體亞類試劑盒、氯金酸、牛血清白蛋白、DMSO購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、吸水紙為美國millipore公司產(chǎn)品。

1.3 鰻弧菌(SMW5)兔多克隆抗體的制備

以滅活鰻弧菌(SMW5)為抗原，免疫新西蘭兔(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)，制備鰻弧菌(SMW5)兔多克隆抗體，并按照文獻[16]的方法檢測多克隆抗體效價。

1.4 鰻弧菌(SMW5)McAb的制備

將滅活鰻弧菌(SMW5)菌液(1×108cfu·mL-1)以每只0.5 mL的劑量，腹腔注射法免疫Balb/C雌性小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)，按文獻[17]的方法制備鰻弧菌(SMW5)McAb。

1.5 單克隆抗體效價測定及IgG亞類鑒定

對建立的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株上清液測定效價，并按文獻[17]的方法制備單克隆抗體細(xì)胞株1H9的小鼠腹水；按照Sigma公司的單克隆抗體亞類鑒定試劑盒對制備的單克隆抗體進行亞類分析。

1.6 交叉反應(yīng)

鰻弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、河流弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、非0-1群霍亂弧菌、類志賀鄰單胞、無乳鏈球菌的滅活菌抗原以1×108cfu·mL-1的濃度分別包被酶標(biāo)板，PBS為陰性對照，間接ELISA法檢測制備的McAb與這些常見病原菌株的交叉反應(yīng)。

1.7 靈敏度的檢測

滅活的鰻弧菌(SMW5)抗原以10倍梯度稀釋，從1×109cfu·mL-1稀釋至1×102cfu·mL-1，4℃過夜包被。一抗為待測單抗，PBS為陰性對照。間接ELISA法分析抗原最低檢測量即為靈敏度。

1.8 膠體金制備

根據(jù)文獻[18]的方法，制備膠體金顆粒。

1.9 金標(biāo)抗體的制備

1.9.1 標(biāo)記時的最佳pH選定 取100 mL膠體金液分別置于3個小燒杯內(nèi)，用0.1 mol·L-1K2CO3溶液分別調(diào)制成不同pH(6.0、7.4、9.6)，每種pH的膠體金溶液各取10 mL，分別加0.07 mg標(biāo)記抗體，標(biāo)記后的樣品應(yīng)用質(zhì)控品進行檢測。

1.9.2 標(biāo)記時最佳抗體濃度選定 按照文獻[18]的方法，取不同量的標(biāo)記單克隆抗體標(biāo)記膠體金，標(biāo)記好后噴涂在聚酯膜上，干燥后制成標(biāo)記墊，并與合格的包有檢測線和控制線的硝酸纖維膜(NC膜)組裝成測試紙條，用質(zhì)控品進行檢測。

1.10 膠體金墊的制備

將金標(biāo)抗體均勻噴涂于聚酯膜上，37℃過夜干燥。

1.11 硝酸纖維素膜制備

1.11.1 檢測線抗體濃度的確定 將抗鰻弧菌兔多克隆抗體用pH7.4的 0.01 mol·L-1PBS(含1% tween-20)分別稀釋成2、1.5、1.0、0.5 mg·mL-14個質(zhì)量濃度梯度，12 000 r·min-1離心10 min去沉淀，以2 μL·cm-1蛋白量噴涂于NC膜上，封閉，干燥，制成試紙條與不同稀釋倍數(shù)的待測菌液進行測試，以確定檢測線的最適包被蛋白濃度。

1.11.2 質(zhì)控線抗體濃度的確定 將抗鰻弧菌兔多克隆抗體按最適濃度噴涂于NC膜的檢測線位置，同時將羊抗鼠二抗用pH7.4的 0.01 mol·L-1PBS(含1% tween-20)分別稀釋成4.8、2.4、1.2、0.6 mg·mL-14個濃度梯度，12 000 r·min-1離心10 min去沉淀，以2 μL·cm-1蛋白量噴涂于NC膜質(zhì)控線位置上，封閉，干燥，制成的試紙條與不同稀釋倍數(shù)的待測菌液進行測試，以確定質(zhì)控線的最適包被蛋白濃度。

1.12 試紙條組裝

在底板上依次貼上樣本墊、膠體金墊、包被好的硝酸纖維素膜、吸水紙，最上面貼一層MAX線標(biāo)貼膜。用切條機將組裝好的樣品切成規(guī)定寬度的試紙條，包裝備用。

1.13 試紙條特異性及靈敏度測試

1.13.1 試劑條檢測特異性 將3株鰻弧菌、7株其他水產(chǎn)重要病原菌培養(yǎng)16 h左右，用試紙條進行特異性分析檢測，BSA為陰性對照。

1.13.2 試紙條檢測靈敏度測試 待測細(xì)菌培養(yǎng)16 h左右，收集菌體，菌體濃度倍比稀釋至約103cfu·mL-1，用試紙條對稀釋樣品進行靈敏度分析試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 多克隆抗體的制備及效價檢測

制備鰻弧菌(SMW5)兔多克隆抗體約50 mL，效價為1∶3.2×105，表明制備的鰻弧菌兔多克隆抗體效價高。

2.2 單克隆抗體的制備及上清液效價和亞型分析

制備鰻弧菌(SMW5)單克隆抗體3株，分別命名為1H9、1C12、6F8，上清的效價分別為1∶6400、1∶3200、1∶800；細(xì)胞系亞類鑒定分別為IgG2a、IgM、IgG2b，結(jié)果如表1。1H9制備小鼠腹水效價為1∶6.4×105。

表1 單克隆抗體上清液效價及亞類鑒定Table 1 Titers and subclasses of McAb supernatant

2.3 單克隆抗體交叉反應(yīng)

單克隆抗體1H9、1C12和6F8均能與免疫抗原鰻弧菌(SMW5、參考株)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，1C12與溶藻弧菌(Js60517NA1)、創(chuàng)傷弧菌(FJ04-L1)、嗜水氣單胞菌(ML316)有非特異性反應(yīng)；6F8與副溶血弧菌(ATCC17802)、哈維氏弧菌(03152)、非0-1群霍亂弧菌(96-2)有非特異性反應(yīng)；1H9與溶藻弧菌(Js60517NA1)、創(chuàng)傷弧菌(FJ04-L1)、副溶血弧菌(ATCC17802)、哈維氏弧菌(03152)、河流弧菌(參考株)、嗜水氣單胞菌 (ML316 、JS01-1)、溫和氣單胞菌(Fp60325NA)、非0-1群霍亂弧菌(96-2)、類志賀鄰單胞(LCCi190625)、無乳鏈球菌(070717LL)，11株菌均無交叉反應(yīng)，如表2所示，結(jié)果表明1H9特異性強。

2.4 靈敏度的檢測

1H9、1C12、6F83株單克隆抗體的靈敏度如表3所示，分別為4×103、2×103、8×103cfu·mL-1。

表2 單克隆抗體特異性試驗Table 2 Specificity test on McAbs

表3 單克隆抗體靈敏度Table 3 Sensitivity test on McAbs

2.5 最佳標(biāo)記pH和最佳標(biāo)記抗體質(zhì)量濃度

不同pH值標(biāo)記的金顆粒測試結(jié)果表明，pH 6.0的金標(biāo)記顆粒離心后發(fā)現(xiàn)有細(xì)小的顆粒沉淀物；pH 9.6的膠體金蛋白結(jié)合不佳，效價低，顯色淺，最低檢出限檢不出結(jié)果；而pH 7.4的膠體金液較好，既沒有沉淀，最低檢出量也很好。

取不同濃度的標(biāo)記單克隆抗體1H9標(biāo)記膠體金顆粒，檢測結(jié)果表明：標(biāo)記單抗1H9加入的量過高(8.0 mg·L-1)，不僅背景不清楚，發(fā)紅，而且易出現(xiàn)假陽性；若質(zhì)量濃度太低(6.0 mg·L-1)，顯色慢、顏色淺，最低檢出限差；以7.0 mg·L-1標(biāo)記抗體濃度最佳，即100 mL膠體金液加0.70 mg標(biāo)記單克隆抗體1H9，最低檢出限好，背景清晰，未出現(xiàn)非特異反應(yīng)。

2.6 NC膜檢測線與質(zhì)控線蛋白包被質(zhì)量濃度

將質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1抗鰻弧菌兔多克隆抗體包被于NC膜上作為檢測線，將質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL-1羊抗鼠二抗包被于NC膜上作為質(zhì)控線，對待測菌液檢測靈敏度高，檢測線和質(zhì)控線清晰，反應(yīng)穩(wěn)定。

2.7 試紙條的特異性分析

將組裝后的試紙條檢測副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌7株水產(chǎn)病原菌、BSA樣本(陰性對照)，檢測結(jié)果均為陰性反應(yīng)，與3株鰻弧菌檢測結(jié)果為陽性反應(yīng)(表4、圖1)，說明本試紙條對鰻弧菌檢測特異性高。

表4 鰻弧菌膠體金試紙條交叉反應(yīng)測試結(jié)果Table 4 Cross reactivity of colloidal gold test strip on 10 bacteria strains

2.8 試紙條的靈敏度檢測

經(jīng)測試，膠體金試紙條檢測的靈敏度為6.3×104cfu·mL-1(表5、圖2)，檢測時間少于10 min。

表5 試紙條檢測鰻弧菌(SMW5)靈敏度試驗結(jié)果Table 5 Sensitivity of gold test strip on V. anguillarum (SMW5)

3 討論與結(jié)論

3.1 鰻弧菌單克隆抗體的篩選

夏永娟[11]以鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)株為抗原，制備獲得的2株抗鰻弧菌單抗1D7和3A3均不與其他檢測弧菌交叉，能特異性地檢測出鰻弧菌，該研究中，使用的抗原鰻弧菌和應(yīng)用于交叉反應(yīng)的細(xì)菌均為標(biāo)準(zhǔn)株。吳圓圓[19]和本研究均以水產(chǎn)病原鰻弧菌菌株為抗原制備單克隆抗體，單克隆抗體的特異性測試應(yīng)用的菌株均為水產(chǎn)常見病原菌，為進一步研制水產(chǎn)病原菌金標(biāo)試紙條的研制奠定基礎(chǔ)。本研究篩選的3株單克隆抗體，1H9特異性好，僅與鰻弧菌呈陽性反應(yīng)，與其他測試的水產(chǎn)病原菌均無交叉反應(yīng)，但1C12與溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌有非特異性的交叉反應(yīng)，6F8與副溶血弧菌、哈維氏弧菌、非0-1群霍亂弧菌有交叉反應(yīng)，這2株單克隆抗體的抗原決定簇可能為部分弧菌所共有。交叉反應(yīng)結(jié)果說明在以全菌為免疫原制備單克隆抗體時，在單克隆抗體細(xì)胞株篩選階段就必須加強與其他水產(chǎn)病原菌進行交叉反應(yīng)測試，有助于盡早獲得特異性好的McAb。

3.2 鰻弧菌膠體金免疫層析檢測方法建立

雙抗夾心法是水產(chǎn)病原菌膠體金免疫層析快速檢測試劑條研制中常用方法，其中病原菌的檢測抗體來源主要包括2種不同抗原位點的單抗[18，20]；1種單抗和兔多克隆抗體組合[21-22]；甚至僅應(yīng)用兔多克隆抗體[23-25]。本研究共篩選出3株鰻菌單克隆抗體，但是在單克隆抗體的交叉反應(yīng)測試中，僅1H9特異性好，而1C12和6F8與部分常見的水產(chǎn)病原菌有非特異性反應(yīng)，因此，為了確保研制的膠體金免疫層析快速檢測試劑盒對鰻弧菌的特異性檢測，選擇制備兔多克隆抗體與1H9組合建立鰻弧菌的雙抗夾心檢測體系，即用1株病原菌單克隆抗體1H9和兔多克隆抗體組合，制備了鰻弧菌膠體金快速檢測試紙條。

在檢測靈敏度主面，Lyerly[26]分別用單、多克隆抗體檢測艱難梭菌Clostridiumdifficile毒素A，認(rèn)為使用多抗作為檢測制劑，檢測靈敏度更高。劉亦娟[24]研究結(jié)果也支持這種觀點。針對遲緩愛德華氏菌，辛志明[18]應(yīng)用單抗和多抗組合，而秦璞[25]僅應(yīng)用兔多抗，研制出遲緩愛德華氏菌金標(biāo)試紙條，兩者檢測靈敏度均為1.00×105cfu·mL-1；同樣是建立鰻弧菌膠體金免疫層析檢測方法，本研究利用單抗和多抗組合，檢測靈敏度為6.3×104cfu·mL-1，而高圓圓[19]以制備的2株鰻弧菌單克隆抗體組合，檢測靈敏度為1.00×105cfu·mL-1，均未顯示出明顯差別。因此，金標(biāo)試紙條檢測靈敏度的影響因素很多，病原特性、抗體質(zhì)量、金標(biāo)制備工藝、金標(biāo)免疫層析快速檢測系統(tǒng)的調(diào)制，甚至外界因素如樣品的量和pH也影響結(jié)果。

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(責(zé)任編輯：林海清)

Rapid Detection of Monoclonal Antibody againstVibrioanguillarumby Using Conjugated Colloidal Gold

WU Bin1，2, FAN Hai-ping1*, WANG Xue-mei3， HUANG Xiao-hong3, ZHANG Xin-yan1, YE Xiao-jun1,LI Zhi-keng4

(1.FreshwaterFisheriesResearchInstituteofFujian,Fuzhou,Fujian350002,China；2.FujianProvincialFisheryTechnicalExtentionCenter,Fuzhou,Fujian350002,China；3.FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China；4.FujianXiamenKuaizhenBiotechCO.,Ltd.,Xiamen,Fujian361006,china)

Vibrioanguillarum, strain SMW5, were inactivated by formaldehyde to be used as the antigen for immunizing Balb/c mice. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) againstV.anguillarumwere obtained and named as 1H9, 1C12, and 6F8 with the isotypes of IgG2a, IgM, and IgG2b, respectively. The titers of 1H9 in ascites of Balb/c mice were 1∶6.4×105. The polyclonal antibody was prepared againstV.anguillarum, with a titer of 1∶3.2×105. A rapid, accurate and easy gold immunochromatographic lateral flow assay methodology (GICA) was developed for detectingV.anguillarum. The monoclonal antibody, 1H9, was conjugated with colloidal gold as a signal generator on the conjugate pad. The polyclonal antibody was used as a capture antibody for the test line (T), and the goat anti-mouse IgG antibody as the capture antibody for the control line (C) on nitrocellose membrane. A GICA test strip was assembled with an absorbing pad, a conjugate pad, and a nitrocellose membrane sprayed with the capture antibody. The sensitivity of the GICA test strip towardsV.anguillarumwas high with a detection limit of 6.3×104cfu·mL-1. The specificity of the assay showed no cross-reaction with 7 other aquaculture pathogens, includingAeromonashydrophila,A.cavia,A.sobria,Edwardsiellatarda, andStreptococcusagalactiae. An accurate confirmation could be completed in 10 min for the assay. It appeared that the newly developed method using the GICA test strip was adequate forV.anguillarumdetection.

Vibrioanguillarum;monoclonal antibody;polyclonal antibody;colloidal gold;gold immunochromatography assay

2016-05-18初稿；2016-07-14修改稿

吳斌(1978-)，男，碩士，高級工程師，主要從事水產(chǎn)動物病害分子免疫學(xué)研究(E-mail：wubinfire@126.com) *通訊作者：樊海平(1967-)，男，碩士，研究員，主要從事水產(chǎn)動物病害研究(E-mail:fanhaiping16@163.com)

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-46-35)；福建省產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)項目[閩發(fā)改高技(2008-796)]

S 917

：A

：1008-0384(2016)11-1145-06

吳斌，樊海平，王雪妹，等.鰻弧菌單克隆抗體-膠體金檢測方法的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(11)：1145-1150.

WU B，F(xiàn)AN H-P，WANG X-M，et al.Rapid Detection of Monoclonal Antibody againstVibrioanguillarumby Using Conjugated Colloidal Gold[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1145-1150.