吳 迪，蔡成崗,2,3，沙如意,2,3

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化研究

吳 迪1，蔡成崗1,2,3，沙如意1,2,3

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

多糖為鐵皮石斛中的主要有效成分，高效浸出有利于其進一步利用。以水為溶劑，對影響鐵皮石斛多糖提取的時間、溫度及料液質量比等因素進行了優(yōu)化研究，并應用苯酚-硫酸法和DNS法考察了鐵皮石斛提取液總糖和單糖的提取率，多糖提取率由兩者之差計算得出。單因素實驗和正交實驗結果表明，料液質量比1∶120、浸提溫度70 ℃、浸提時間90 min時提取鐵皮石斛多糖效果最好，在此工藝條件下，鐵皮石斛多糖提取率為55.2%。

鐵皮石斛；多糖;提取工藝；單因素實驗；正交實驗

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是中國傳統(tǒng)名貴中藥，歷代古籍醫(yī)書均有記載。《本草綱目》載：“俗方最以補虛，主治傷中，除痹下氣，補五臟虛勞贏瘦，強陰益精；厚腸胃，補內(nèi)絕不足，逐皮膚邪熱瘁氣，治男子腰腳軟弱，健陽，補腎益力，壯筋骨，暖水臟，輕身延年等”；《本昌思辨錄》認為,石斛，為腎藥，為肺藥，為腸胃藥[1]。鐵皮石斛具養(yǎng)胃生津、潤肺止咳、滋陰清熱、清音明目之功效，含有多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類、芴酮化合物、糖苷類、氨基酸等藥理成分[2-8]。多糖作為鐵皮石斛的主要有效成分，藥理作用包括增強機體免疫能力、抗氧化、抗衰老、降血糖、養(yǎng)陰生津和抑制腫瘤等[9-15]。

近年來，鐵皮石斛人工栽培面積逐步擴大，受到廣泛的關注。其藥用主要成分多糖的提取對于鐵皮石斛的高效利用和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。目前，國內(nèi)有研究人員針對鐵皮石斛多糖采用水法提取[16]、酶法提取[17-19]、超聲波提取[20]等，其中酶法及超聲提取法較直接水提法效果更好，多糖質量濃度因鐵皮石斛采收季節(jié)及生長年份不同而存在一定的差異；在提取實驗設計中，采用正交實驗[21]和響應面分析[16，19]等設計方法，獲得了較佳的提取工藝。因鐵皮石斛主要在中國栽培，國外對其研究報道較少。鑒于目前鐵皮石斛多糖提取工藝條件存在一定的差異，本研究為探討鐵皮石斛中多糖的質量濃度，采用單因素和正交實驗方法對鐵皮石斛多糖進行了提取的工藝優(yōu)化研究，以期為掌握鐵皮石斛中多糖的質量濃度并為后續(xù)多糖的構效關系等研究提供一定的參考。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

鐵皮石斛，購自市場，為3年生鐵皮石斛鮮條。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉等均為分析純，購自華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司；水為去離子水。

1.2 實驗設備

水浴鍋，江蘇金壇良友實驗儀器廠；臺式高速冷凍離心機，德國希格瑪(SIGMA)公司；粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計(UV-5500PC)，上海元析儀器有限公司；電子天平(PL303)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 提取工藝

石斛鮮條→切碎→60 ℃烘干→磨粉→過篩→稱樣→水浴提取→定容→離心→上清液備用→糖質量濃度測定。

1.4 糖濃度測定

單糖質量濃度測定采用DNS法[22](3,5-二硝基水楊酸比色法)，總糖質量濃度測定采用苯酚-硫酸法[23]，多糖提取率以總糖提取率減去單糖提取率進行計算。

1.4.1 DNS法

分別取標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL試管中，分別準確加入DNS試劑2 mL，沸水浴加熱2 min，流水冷卻，用水補足到25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值，以質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并建立方程。

1.4.2 苯酚硫酸法

分別取標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，各以水補至2.0 mL，然后先后加入1.0 mL苯酚(5%質量濃度)和5.0 mL濃硫酸，混合后靜置10 min，搖勻并于室溫下放置20 min，于490 nm下測定吸光度值，空白實驗以1.0 mL水代替樣品進行，并繪制吸光度為縱坐標、葡萄糖質量濃度為橫坐標的標準曲線，建立回歸方程。

1.5 單因素實驗

1.5.1 料液質量比的確定

精密稱取0.2 g鐵皮石斛粉末，在浸提溫度60 ℃、浸提時間90 min條件下，研究1∶90、1∶120和1∶150料液質量比對提取效果的影響。

1.5.2 浸提溫度的確定

精密稱取0.2 g鐵皮石斛粉末，在最佳料液質量比條件下，以蒸餾水為溶劑，在50、70、90 ℃溫度下浸提90 min，測定提取效果。

1.5.3 浸提時間的確定

精密稱取0.2 g鐵皮石斛粉末，在最佳料液質量比和浸提溫度條件下，以蒸餾水為溶劑，研究浸提時間60、90、120 min對鐵皮石斛多糖提取效果的影響。

1.6 正交實驗

以單因素實驗得出的最佳料液質量比、浸提溫度和浸提時間為中心點，設計正交實驗，因素和水平如表1所示。

表1 正交實驗因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平料液質量比A浸提溫度/℃B浸提時間/minC11∶90506021∶120709031∶15090120

2 結果與討論

2.1 標準曲線

2.1.1 DNS法標準曲線

DNS法標準曲線方程為y=0.742x+ 0.015(R2=0.998，R為相關系數(shù))，該線性方程說明在圖1所示的質量濃度范圍內(nèi)葡萄糖質量濃度與吸光度有良好的線性關系。

2.1.2 苯酚-硫酸法標準曲線

苯酚-硫酸法標準曲線方程為y=0.876x+0.027(R2=0.997)，該線性方程說明在圖2所示的質量濃度范圍內(nèi)葡萄糖質量濃度與吸光度有良好的線性關系。

圖1 DNS法測定還原糖標準曲線Fig.1 Standard curve for reducing carbohydrate analysis by DNS method

圖2 苯酚-硫酸法測定總糖標準曲線Fig.2 Standard curve for total carbohydrate analysis by phonel-sulfate method

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 料液質量比對鐵皮石斛多糖提取率的影響

選擇料液質量比1∶90，1∶120，1∶150三個水平，考查不同料液質量比對鐵皮石斛多糖提取率的影響，將所有提取液定容至250 mL后離心，多糖提取率用百分數(shù)表示。實驗結果見表2。

表2 料液質量比對提取效果的影響Table 2 Effects of substrate and liquid ratio on extraction results

由表2可見，料液質量比的增加會增加鐵皮石斛多糖的溶出量。當料液質量比為1∶120時，總糖提取率和單糖提取率均最高，多糖提取率也達到最高值51.3%。由此結果可知，料液質量比為1∶120時提取效果最好。

2.2.2 浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

選擇浸提溫度50、70、90 ℃三個水平，考查不同浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響，實驗結果見表3。

表3 浸提溫度對提取效果的影響Table 3 Effects of temperature on extraction results

由表3可知，浸提效果隨著溫度升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當浸提溫度為70 ℃時，鐵皮石斛總糖提取率和單糖提取率均最高，多糖提取率也達到最高值54.8%。但隨著溫度的升高，多糖的提取率卻有所下降，故浸提溫度為70 ℃時鐵皮石斛多糖提取效果最好。

2.2.3 浸提時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

浸提時間選擇60、90、120 min三個水平，考查不同浸提時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響，實驗結果見表4。

表4 浸提時間對提取效果的影響Table 4 Effects of time on extraction results

由表4可見,浸提時間的增加會增加多糖的溶出量，但并不是浸提時間越長，提取效果越好，當浸提時間達到120 min時，鐵皮石斛多糖提取率反而降低，僅34.6%。當浸提時間為90 min時，鐵皮石斛總糖提取率和單糖提取率均最高，多糖提取率也達到最高值52.7%。故浸提時間初步定為90 min。

2.3 鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝條件

本研究以鐵皮石斛多糖為指標，以單因素實驗中獲得的最適提取條件為基礎，再以正交實驗方法進行優(yōu)化。實驗中以水為提取溶劑，確定料液質量比、浸提時間和浸提溫度對提取效果的影響。取鐵皮石斛粉末0.2 g，按照設定的方法提取后定容至250 mL并離心，測定總糖和單糖的提取率，以兩者之差作為多糖提取率。實驗結果如表5所示。

表5 正交實驗結果
Table 5 Results of orthogonal experiment

實驗號ABC總糖提取率/%單糖提取率/%多糖提取率/%111176．037．138．9212277．836．641．2313374．832．742．1421284．534．350．2522390．040．050．0623187．838．249．6731374．634．939．7832187．848．938．9933273．941．542．4K1j122．2128．8127．4K2j149．8134．1133．8K3j120．9130．0131．7K1j/340．742．942．5K2j/349．944．744．6K3j/340．343．343．9極差R9．200．422．12最佳組合A2C2B2

由正交實驗極差分析可知，因素主次順序為A、C和B，影響結果的因素依次為料液質量比、浸提時間和浸提溫度。最佳組合是A2C2B2，即提取工藝參數(shù)料液質量比為1∶120，浸提溫度為70 ℃，浸提時間為90 min(圖3)。按照正交實驗結果進行驗證實驗，鐵皮石斛多糖得率為55.2%。

3 結 語

圖3 因素、水平對多糖提取效果的影響Fig.3 Effects of factors and levels on extraction results of polysaccharide

鐵皮石斛作為名貴中藥材具有多種功能，多糖為其主要有效成分。目前，研究人員采用水法、酶法和超聲波提取等手段進行了提取工藝研究，結果存在一定的差異。本研究采用單因素和正交實驗的方法對鐵皮石斛多糖的提取工藝進行了優(yōu)化，單因素實驗設計有利于獲得選定的各個因素對提取效果的影響。在此基礎上，采用正交實驗設計考察各個因素之間的相互作用。單因素和正交實驗結果都表明，料液質量比1∶120，浸提溫度70 ℃，提取時間90 min時多糖提取效果最好。單因素和正交實驗結果一致，可能是因為在實驗設計中選擇的各因素水平之間差值較大，在后續(xù)實驗中可以將各因素的水平值進一步細化。正交實驗還說明，對鐵皮石斛中多糖提取效果影響的因素大小依次為料液質量比、浸提時間和浸提溫度，在最佳條件下鐵皮石斛多糖提取率為55.2%。后續(xù)研究需要在確定鐵皮石斛原料、水分含量的基礎上，結合其他輔助提取手段，進一步對最佳提取工藝進行優(yōu)化，在此基礎上開展鐵皮石斛多糖的分離和結構分析等方面的繼續(xù)研究工作，以便為鐵皮石斛的綜合利用和精深加工尋找科學依據(jù)。

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Optimization of polysaccharide extraction conditions ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo

WU Di1, CAI Chenggang1,2,3, SHA Ruyi1,2,3
(1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023, China;2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, China; 3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources, Hangzhou 310023, China)

Polysaccharide is the most important functional ingredient inDendrobiumofficinaleKimura et Migo, and it is important to extract the polysaccharides efficiently for the utilization ofD.officinaleKimura et Migo. The extraction conditions such as extraction time, extraction temperature and the ratio of substrate to extraction solution of polysaccharide fromD.officinaleKimura et Migo by water using single factor and orthogonal experiments were optimized.The extraction ratio of polysaccharide was calculated by subtract between the total polysaccharide and monosaccharide, which were analyzed by phenol sulfuric acid method and DNS method, respectively.The single factor experiments results showed that the ratio of substrate to water of 1∶120, extraction temperature of 70 ℃ and extraction time of 90 min are the optimal conditions, which are also of the optimal extraction conditions of orthogonal experiments. The identified experiments showed that under the optimal conditions the maximal extraction quantity is of 55.2%.

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; polysaccharide; extraction technology; single factor experiment; orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1671-8798.2016.06.006

2016-10-22

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201611057014)；浙江科技學院科研啟動基金項目(702103E03)

吳 迪(1994— )，男，浙江省湖州人，2014級生物工程專業(yè)本科生。

蔡成崗，副教授，博士，主要從事食品生物技術研究。

R284.2

A

1671-8798(2016)06-0444-06