郭振紅，曹雪濤

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腫瘤免疫細(xì)胞治療的現(xiàn)狀及展望

郭振紅，曹雪濤

近年來(lái)，腫瘤的免疫治療因其對(duì)于常規(guī)療法無(wú)效的晚期腫瘤具有顯著療效而受到極大關(guān)注，并于2013年被《Science》評(píng)為年度十大科技突破之首，為轉(zhuǎn)移性晚期腫瘤治療帶來(lái)新的希望。實(shí)際上，免疫療法已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展。腫瘤的免疫療法始于Coley的發(fā)現(xiàn)，他于1891年報(bào)道給患者注射細(xì)菌產(chǎn)物后可以引起腫瘤縮小，被認(rèn)為是誘導(dǎo)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。1909年，Ehrlich提出假設(shè)“免疫系統(tǒng)可以保護(hù)機(jī)體免于發(fā)生腫瘤”，并由Thomas等和Burnet進(jìn)一步發(fā)展，提出“腫瘤的免疫監(jiān)視”理論。腫瘤抗原的設(shè)想和發(fā)現(xiàn)則推動(dòng)了免疫系統(tǒng)與腫瘤之間相互作用的研究，并奠定了腫瘤免疫治療的“中心法則”，即CD8+T細(xì)胞可以特異性地殺傷表達(dá)腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。除了CD8+T細(xì)胞，20世紀(jì)70年代DC和NK細(xì)胞的先后發(fā)現(xiàn)及近年來(lái)的進(jìn)一步研究更證明了這兩種細(xì)胞在腫瘤免疫中的重要作用：2010年，DC疫苗成為第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的治療性腫瘤疫苗。2015年底，美國(guó)前總統(tǒng)卡特現(xiàn)身說(shuō)法，證實(shí)利用PD-1抗體的免疫治療配合手術(shù)和放療控制了他的黑素瘤。腫瘤的免疫治療在近10年來(lái)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，然而，腫瘤免疫治療領(lǐng)域仍然存在著許多懸而未決的科學(xué)難題，仍然需要進(jìn)一步強(qiáng)化基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。在本文中，筆者以T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞這三個(gè)在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要效應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)近年來(lái)免疫治療的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)后續(xù)需要解決的問(wèn)題作一下展望。

1　T細(xì)胞治療

T細(xì)胞是目前認(rèn)為唯一能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。DC將抗原提呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和增殖，包括CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+殺傷性T細(xì)胞。腫瘤抗原特異性T細(xì)胞一直是腫瘤治療的重要目標(biāo)。目前來(lái)看，正在進(jìn)行的針對(duì)T細(xì)胞的腫瘤免疫治療，可以分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是T細(xì)胞過(guò)繼療法，主要包括Steve Rosenberg教授一直在進(jìn)行的從患者TIL中擴(kuò)增腫瘤特異性T細(xì)胞進(jìn)行回輸；另一類(lèi)是通過(guò)基因修飾的方法，在正常T細(xì)胞表面表達(dá)能夠識(shí)別腫瘤抗原的受體，包括T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）基因修飾T細(xì)胞（TCR-T）和嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）修飾T細(xì)胞（CAR-T）。而第二類(lèi)是免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法。

1.1T細(xì)胞過(guò)繼療法

作為能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，T細(xì)胞的過(guò)繼回輸治療開(kāi)創(chuàng)了免疫細(xì)胞治療腫瘤的先河。早在1985年，Rosenberg等就發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射IL-2和LAK細(xì)胞可以使某些轉(zhuǎn)移性黑素瘤維持長(zhǎng)久地消退，提示有特異性的T細(xì)胞擴(kuò)增。但由于全身性的毒性反應(yīng)及Treg的擴(kuò)增導(dǎo)致療效不佳，最終無(wú)法全身使用IL-2進(jìn)行腫瘤治療。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從黑素瘤中提取出來(lái)的淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）含有能識(shí)別自身腫瘤的特異性細(xì)胞。隨后臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自身TILs可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的客觀(guān)消退。

在從患者TILs中擴(kuò)增腫瘤特異性T細(xì)胞后進(jìn)行回輸?shù)脑囼?yàn)中，早期發(fā)現(xiàn)注射幾天后在循環(huán)中就無(wú)法找到相應(yīng)的細(xì)胞；后來(lái)發(fā)現(xiàn)，在TILs回輸之前，實(shí)行非清髓性預(yù)處理可以有效促進(jìn)腫瘤的消退以及回輸淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)期存活及擴(kuò)增，從而達(dá)到良好的治療效果：客觀(guān)反應(yīng)率達(dá)30%～60%。目前TILs療法主要集中在黑素瘤的治療，偶有涉及宮頸癌和膽管癌。主要原因在于，黑素瘤的外顯子突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他腫瘤，這些大量的突變所編碼的腫瘤抗原表位成為能夠重復(fù)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性TILs的基礎(chǔ)，也是后續(xù)TIL治療的靶標(biāo)。在轉(zhuǎn)移性黑素瘤，結(jié)合化療或者放療，TILs療法的客觀(guān)反應(yīng)率可以達(dá)到50%～70%。但是，一系列原因阻止了TIL療法的廣泛應(yīng)用：早期分離步驟需要新鮮的腫瘤組織；TILs擴(kuò)增有難度；擴(kuò)增后的TIL細(xì)胞功能受損；來(lái)自于腫瘤微環(huán)境的負(fù)向調(diào)節(jié)（如PDL的表達(dá)以及Treg的活化）等。如何解決這些問(wèn)題將成為日后研究的重點(diǎn)。最新的研究提示，黑素瘤患者可以通過(guò)檢測(cè)外周血中PD-1的表達(dá)來(lái)發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞，該結(jié)果對(duì)于TILs療法的影響將拭目以待。

為了產(chǎn)生針對(duì)其他腫瘤的特異性T細(xì)胞，相應(yīng)的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。首先，研究者把正常的、能夠識(shí)別腫瘤通過(guò)MHC分子提呈腫瘤抗原的TCR插入到患者T細(xì)胞上，擴(kuò)增后回輸患者。2006年，研究者首次發(fā)現(xiàn)，特異性表達(dá)識(shí)別MART-1黑素瘤TCR的T細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤消退。但特異性問(wèn)題隨之而來(lái)：由于TCR識(shí)別抗原具有MHC限制性，因此TCR特異性T細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到限制。另外，TCR與抗原之間的親和力很弱，容易造成交叉反應(yīng)和脫靶毒性。

為解決這一問(wèn)題，Eshhar等提出用抗原-抗體的識(shí)別區(qū)與TCR的信號(hào)分子融合可能會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞特異性活化而不需要識(shí)別MHC分子，這種融合結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為CAR。這種由CAR修飾的T細(xì)胞（CAR-T）克服了MHC的限制性，從而更有效地殺傷抗原特異性的腫瘤細(xì)胞；同時(shí)，由于不依賴(lài)于MHC分子，減少了由于腫瘤降低MHC分子表達(dá)而造成的免疫逃逸，而且，抗原抗體結(jié)合特異性好、親和力高，這一切決定了CAR-T療法在臨床應(yīng)用上具有很大的優(yōu)勢(shì)。2010年，表達(dá)識(shí)別CD19的嵌合受體的淋巴細(xì)胞用于治療晚期B淋巴瘤療效明顯；隨后，CD19特異性的CAR-T被應(yīng)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤，收到了很好的療效：病情得到超過(guò)2年的長(zhǎng)期緩解。在這些臨床試驗(yàn)中，回輸?shù)蛣┝康腡細(xì)胞在體內(nèi)大量擴(kuò)增，同時(shí)伴隨腫瘤細(xì)胞的裂解和正常CD19+B細(xì)胞的清除。由于正常B細(xì)胞清除、腫瘤細(xì)胞裂解和大量細(xì)胞因子分泌導(dǎo)致的副作用也時(shí)有報(bào)道。通過(guò)對(duì)CD19特異性CAR治療B細(xì)胞惡性腫瘤（包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤）的臨床療效進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)，總反應(yīng)率為48%，6個(gè)月和1年的無(wú)進(jìn)展生存率分別為43%和27%，可以提示CAR-T在治療血液性惡性腫瘤確實(shí)具有強(qiáng)大的療效。

CAR的結(jié)構(gòu)經(jīng)歷快速的發(fā)展。其基本結(jié)構(gòu)包括兩部分，胞外包括腫瘤抗原抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，胞內(nèi)是T細(xì)胞活化的分子（如CD3ζ、FcRγ、CD28或者41BB、FcRγ），二者連在一起組裝在T細(xì)胞上。CAR結(jié)構(gòu)第一代只有一個(gè)胞內(nèi)信號(hào)組分，主要是CD3ζ或者FcRγ，T細(xì)胞可以被活化但無(wú)法增殖，主要靶向不同惡性腫瘤細(xì)胞表面的L1CAM、CD20和carbonicanhydrase-Ⅸ（CAⅨ），但療效甚微。第二代CAR具有兩個(gè)胞內(nèi)信號(hào)組分，包括一個(gè)共刺激分子，如CD28、41BB、OX40或者ICOS和CD3ζ，這樣的結(jié)構(gòu)決定了T細(xì)胞即便沒(méi)有外源性共刺激分子也可以不斷增殖，而且共刺激分子可以活化相關(guān)的信號(hào)通路如ERKp38、JNK和NF-κB等。第三代CAR具有三個(gè)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，包括CD28、CD3ζ、41BB或OX40。研究表明，胞內(nèi)有三個(gè)共刺激信號(hào)的三代CAR結(jié)構(gòu)使細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤裂解能力和更多的因子分泌，并在小鼠體內(nèi)具有更強(qiáng)的腫瘤抑制能力。第四代CAR結(jié)構(gòu)與前三代不同，因表達(dá)特定的細(xì)胞因子（目前主要是IL-12）而被稱(chēng)為T(mén)RUCK（T-cells redirected for universal cytokine killing），可以在具有免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境中釋放促炎性因子，從而有助于招募并活化更多的免疫細(xì)胞而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

由于TCR-T和CAR-T都是需要根據(jù)特定的腫瘤抗原來(lái)設(shè)計(jì)TCR和CAR，因而選擇合適的靶向腫瘤抗原就非常重要。一個(gè)用HER2/Neu特異性的CAR（CD28-CD137-z）-T細(xì)胞治療的患者在回輸細(xì)胞后死亡，可能與心肺等重要正常組織表達(dá)相應(yīng)的抗原有關(guān)。另外，哪種T細(xì)胞亞群更適合用作制備TCR-T和 CAR-T從而保證其在體內(nèi)更好地生存、增殖和記憶形成？有研究發(fā)現(xiàn)，不成熟的細(xì)胞，如中心記憶性T細(xì)胞（TCM）比效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（TEM）和效應(yīng)性T細(xì)胞（TE）在體內(nèi)能更好地存活并具有更好的抗腫瘤效果。更有研究者發(fā)現(xiàn)，一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞亞群具有比TCM更強(qiáng)的抗腫瘤效果。另外，目前CAR-T主要應(yīng)用于血液腫瘤，在實(shí)體瘤由于缺乏特異性的TAA靶點(diǎn)、實(shí)體瘤微環(huán)境的抑制性特點(diǎn)以及腫瘤體積巨大T細(xì)胞難以趨化等因素療效欠佳。

1.2免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法

除了采用過(guò)繼回輸腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)對(duì)腫瘤的免疫效應(yīng)，目前采用免疫檢查點(diǎn)抑制方法，即“松開(kāi)剎車(chē)”的方法，來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞的功能，也取得了令人振奮的結(jié)果。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了共刺激抑制分子包括CTLA-4、PD-1及PD-L1的抗體用于治療晚期黑素瘤、小細(xì)胞肺癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌，多個(gè)相關(guān)抗體目前用于多種腫瘤的臨床試驗(yàn)。在T細(xì)胞活化增殖的過(guò)程中，CD28作為最重要共刺激分子與來(lái)自于抗原提呈細(xì)胞的CD80/CD86作用，促進(jìn)T的活化，隨后胞內(nèi)預(yù)先合成的CTLA-4會(huì)轉(zhuǎn)移到胞膜，以更強(qiáng)的結(jié)合力與CD80/CD86結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化與增殖。由于CTLA-4在負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的重要作用，在臨床試驗(yàn)中，其阻斷性抗體往往炎性副反應(yīng)發(fā)生率非常高。但由于在黑素瘤患者體內(nèi)存在高頻腫瘤特異性的T細(xì)胞，因而仍大約有20%的患者可以從該項(xiàng)治療中獲益。2011年CTLA-4抗體ipilimumab由于Ⅲ期臨床治療晚期惡性黑素瘤整體生存率顯著延長(zhǎng)而在美國(guó)和歐洲獲批上市。在非黑素瘤的腫瘤中，ipilimumab目前顯示了有限的抗腫瘤效應(yīng)。例如在腎癌，ipilimumab單獨(dú)應(yīng)用只能引起10%的部分反應(yīng)率。在副作用方面，15%～30%接受CTLA-4抗體治療的患者往往伴隨嚴(yán)重的免疫相關(guān)的副作用，有時(shí)甚至致死，主要發(fā)生在皮膚、腸道和內(nèi)分泌腺體。

PD-1功能與CTLA-4相似，但是，雖然T細(xì)胞活化后也表達(dá)PD-1，阻斷PD-L1與PD-1相互作用后的效應(yīng)主要發(fā)生于腫瘤的免疫微環(huán)境中：PD-L1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，這也與臨床觀(guān)察到的PD-1和PD-L1抗體在自身免疫方面副作用要低于CTLA-4的情況相一致；另外，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示，相比CTLA-4抗體，PD-L1與PD-1抗體具有更廣泛的抗腫瘤活性。目前，多個(gè)PD-1和PD-L1抗體已經(jīng)獲批上市?？筆D-1 nivolumab第一個(gè)臨床試驗(yàn)就提示可以治療多種腫瘤，包括上皮細(xì)胞癌、惡性黑素瘤和和結(jié)直腸癌。在晚期難治性非小細(xì)胞肺癌、腎癌和惡性黑素瘤，其客觀(guān)反應(yīng)率分別為17%、27%和31%；而且即便停藥后療效仍可維持，長(zhǎng)期隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，其總存活期分別為9.9、22.4和16.8個(gè)月。最近一個(gè)Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用nivolumab作為一線(xiàn)藥物治療晚期黑素瘤，比標(biāo)準(zhǔn)的化療具有優(yōu)勢(shì)；PD-1和PD-L1的阻斷性抗體已經(jīng)在惡性黑素瘤、腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞性肺癌的臨床試驗(yàn)中證實(shí)有效。Nivolumab和MPDL3280A已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，但他們?cè)诎螂装?、霍奇金淋巴瘤、頭頸部腫瘤、胃腸道腫瘤及乳腺癌中的抗癌效果仍需要進(jìn)一步地研究。

除了CTLA-4和PD-1，目前也有很多其他的免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)或者即將走上臨床試驗(yàn)，其中很多與PD-L1共同表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，包括LAG-3、KIR、B7-H3和TIM-3、TIGIT、VISTA等。另外，雖然IDO不是經(jīng)典意義上的檢查點(diǎn)分子，但是在某些腫瘤中，那些通過(guò)過(guò)表達(dá)IDO來(lái)發(fā)揮抑制功能的通路在下調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在，IDO抑制劑D-1MT和小分子抑制劑INCB024360、NLG919都已經(jīng)進(jìn)入臨床，初步顯示出抗腫瘤效應(yīng)。

2　NK細(xì)胞治療

NK細(xì)胞因其不需預(yù)先致敏就可以殺死病毒感染的細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞而得名。除此之外，NK細(xì)胞還可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，因此，NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中非常重要的一群細(xì)胞。NK細(xì)胞的功能執(zhí)行主要通過(guò)兩大類(lèi)細(xì)胞表面受體，包括殺傷細(xì)胞活化受體（killer activation receptor，KAR）和殺傷細(xì)胞抑制受體（killer inhibitory receptor，KIR）進(jìn)行調(diào)控。正常情況下，KIR 與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合，產(chǎn)生抑制性信號(hào)，盡管自身細(xì)胞上多糖類(lèi)抗原與KAR結(jié)合產(chǎn)生活化性信號(hào)，但由于抑制性占主導(dǎo)地位，從而保證了自身細(xì)胞不被NK殺傷。但是，當(dāng)細(xì)胞表面MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)降低或者缺失，抑制性信號(hào)功能減弱，NK則被活化，殺傷相應(yīng)的細(xì)胞。活化后的NK細(xì)胞通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性顆粒，或者表達(dá)Fas 和TRAIL誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。

在對(duì)NK細(xì)胞的分子特征和功能調(diào)控深入研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療可能引發(fā)腫瘤免疫治療的新的突破。雖然早期的IL-2活化的淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokine-activated killer cell，LAK）治療腫瘤效應(yīng)不佳，但NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)在2002年獲得確認(rèn)。接受同種異體骨髓回輸?shù)募毙粤＜?xì)胞白血?。╝cute myeloblastic leukemia，AML）患者，由于KIR 和HLA-C不匹配，復(fù)發(fā)率明顯降低，表明供體來(lái)源的NK細(xì)胞介導(dǎo)了針對(duì)AML的同種異體抗原的反應(yīng)而沒(méi)有導(dǎo)致移植物抗宿主反應(yīng)。根據(jù)這一策略，向AML患者過(guò)繼回輸體外活化的同種異體KIR不匹配N(xiāo)K細(xì)胞，或者向惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者回輸體外活化的自體NK細(xì)胞獲得了一定的治療效果。但目前看來(lái)，過(guò)繼回輸NK細(xì)胞若想獲得更好的療效，還需要解決NK細(xì)胞抑制性受體的效應(yīng)并清除Treg等一系列問(wèn)題。

為了解決NK細(xì)胞抑制性受體的效應(yīng)，研究者們進(jìn)行了深入的研究。體外實(shí)驗(yàn)表明，使用IPH2102單抗阻斷KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3，可以增加NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。在AML和多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究已證實(shí)KIR單抗的安全性，雖然目前KIR單抗單獨(dú)應(yīng)用并沒(méi)有展示出顯著的抗腫瘤效應(yīng)，然而其與CTLA-4或PD-1抑制劑聯(lián)用效果仍值得期待。除此之外，更多的研究也集中于抑制性受體，如NKG2A或者LAG3等，觀(guān)察其對(duì)NK細(xì)胞抗腫瘤功能的影響，對(duì)其功能將拭目以待。除了研究KIR和KAR 對(duì)NK功能的調(diào)控，人們對(duì)其他分子對(duì)NK細(xì)胞的功能調(diào)控也進(jìn)行了研究。近期的研究表明，某些情況下，活化的NK細(xì)胞也表達(dá)PD-1和CTLA4。一項(xiàng)研究表明，在MM患者體內(nèi)，NK細(xì)胞表達(dá)PD-1，而且，應(yīng)用PD-1單抗（CT-011）可以恢復(fù)NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)；此外，應(yīng)用PD-L1的IgG1單抗還可能激發(fā)NK細(xì)胞的ADCC效應(yīng)。目前，CTLA-4抗體對(duì)NK細(xì)胞的影響并不清楚，但是，聯(lián)合應(yīng)用溶瘤病毒和CTLA4阻斷抗體表明NK細(xì)胞參與了抗腫瘤效應(yīng)。由于近期靶向PD-1和CTLA-4的多個(gè)抗體獲得批準(zhǔn)，因此，進(jìn)一步深入研究PD-1和CTLA-4對(duì)NK功能的影響具有重要的意義。

同時(shí)，由于CAR-T在血液腫瘤治療中的良好效果，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在NK細(xì)胞表達(dá)腫瘤CAR也獲得初步成功。研究者們用NK細(xì)胞系NK-92或者從外周血分離出來(lái)的原代NK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染針對(duì)多種特異性腫瘤抗原的CAR，如CD19、CD20、HER2等，在異種移植模型中顯示了針對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)增強(qiáng)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。相比較于CAR-T，表達(dá)CAR的NK細(xì)胞由于不能自分泌IL-2從而決定了其體內(nèi)生存期較短，從而避免了一些脫靶效應(yīng)。同時(shí)，即便靶向抗原在腫瘤上的表達(dá)迅速丟失，表達(dá)CAR的NK仍然可以通過(guò)自身的KAR獲得活化，因此攜帶CAR的NK細(xì)胞具有更大的優(yōu)勢(shì)。人們期待表達(dá)CAR的原代NK細(xì)胞在治療白血病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，從而更好地了解表達(dá)CAR的NK細(xì)胞在患者體內(nèi)的行為及造成的結(jié)果。

3　DC治療性疫苗

DC是專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，負(fù)責(zé)對(duì)抗原進(jìn)行加工處理后提呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和增殖，激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。由于DC在免疫應(yīng)答過(guò)程中的核心地位，而且DC在體外培養(yǎng)成功，使其成為腫瘤免疫治療中最重要的力量之一。第一個(gè)基于DC的治療性腫瘤疫苗的臨床試驗(yàn)是應(yīng)用于B細(xì)胞淋巴瘤，此后，大量的臨床研究應(yīng)用于多種腫瘤，到目前為止，在惡性黑素瘤、前列腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腎癌已經(jīng)進(jìn)行到Ⅲ期臨床試驗(yàn)。Dendreon公司的sipuleucel-T（或稱(chēng)Provenge）于2010年獲得FDA的批準(zhǔn)，它利用患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)DC，并在培養(yǎng)過(guò)程中加入前列腺癌抗原PAP-GM-CSF后回輸給患者，應(yīng)用于治療無(wú)癥狀或癥狀輕微的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)難治性前列腺癌，是迄今為止首個(gè)被FDA批準(zhǔn)的治療性腫瘤疫苗。盡管客觀(guān)有效率評(píng)價(jià)顯示治療效果有限（＜5%），但在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，sipuleucel-T可以比安慰劑平均延長(zhǎng)患者4.1個(gè)月的生存期（25.8個(gè)月相對(duì)于21.7個(gè)月）。這一系列的臨床試驗(yàn)證明，基于DC疫苗的治療非常安全，能夠在腫瘤患者體內(nèi)激發(fā)保護(hù)性的抗腫瘤免疫而沒(méi)有發(fā)生重大的毒副作用。但是如何進(jìn)一步提高療效，就成為目前DC治療性疫苗研究的重點(diǎn)。

目前基于DC的治療性腫瘤疫苗，主要分為兩種，一種是DC體外荷載抗原后，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，另外一種是誘導(dǎo)DC在體內(nèi)攝取腫瘤抗原。二者的共同目的都是最大程度活化腫瘤抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

3.1利用DC體外荷載抗原的治療性疫苗

除了近年來(lái)有研究從外周血分離DC用于免疫治療，通過(guò)外周血CD14+單核細(xì)胞或者CD34+的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得成熟DC是最常用的方法。在此過(guò)程中，DC的培養(yǎng)方法、誘導(dǎo)DC成熟的方式、腫瘤抗原的選擇及荷載方式以及免疫方式是決定DC疫苗抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵因素。

3.1.1DC的培養(yǎng)方式 盡管利用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)DC被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但由此產(chǎn)生的所謂IL-4DC與體內(nèi)傾向于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的CD14+皮膚DC相似，因而在誘導(dǎo)Th1型抗腫瘤免疫反應(yīng)中不是最優(yōu)選擇。以往的研究表明，郎格漢斯細(xì)胞（langerhans cell，LC）在激活抗原特異性的CTL反應(yīng)方面，優(yōu)于皮膚DC和moDC。因此，研究者開(kāi)發(fā)了新的培養(yǎng)DC的方法，利用新的細(xì)胞因子組合從外周血CD14+單核細(xì)胞或者CD34+的造血干細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生LC樣的DC，以期激發(fā)更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。

3.1.2誘導(dǎo)DC成熟的方式 DC的成熟狀態(tài)是決定DC免疫效果的重要因素。目前常用的促進(jìn)DC成熟的策略包括使用某些細(xì)胞因子組合，如TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2或者Toll樣受體（TLR4、TLR7和TLR9）的激動(dòng)劑。其中，利用TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IFN-α和TLR3激動(dòng)劑poly（I：C）來(lái)培養(yǎng)促進(jìn)Th1型反應(yīng)的DC，已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)治療復(fù)發(fā)性惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑素瘤、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。另外一種值得一提的誘導(dǎo)DC成熟的方式是利用電穿孔的方式，在非成熟DC組成性表達(dá)三個(gè)分子TLR4、CD40L和CD70，由此產(chǎn)生的TriMixDC在黑素瘤患者取得了很有希望的結(jié)果。需要注意的是，這些TLR激動(dòng)劑，不僅影響DC的功能狀態(tài)，還影響到腫瘤微環(huán)境中具有免疫負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)的細(xì)胞MDSCs和Tregs的生成。

3.1.3腫瘤抗原的選擇 從1991年第一個(gè)腫瘤抗原被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，已經(jīng)有100多種腫瘤抗原陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。對(duì)于已經(jīng)明確的腫瘤抗原，可以通過(guò)合成抗原肽或編碼特定腫瘤抗原的核酸來(lái)制備腫瘤抗原。對(duì)于未明確的腫瘤抗原，制備DC疫苗時(shí)，通常采用反復(fù)凍融腫瘤細(xì)胞，利用凋亡的腫瘤細(xì)胞或凋亡小體的方法來(lái)獲取腫瘤抗原，亦可將腫瘤細(xì)胞與DC相融合。最新的研究表明，腫瘤的外泌體因?yàn)楹写罅康哪[瘤細(xì)胞的信息，在決定腫瘤的器官轉(zhuǎn)移偏好及早期診斷中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也可以作為腫瘤抗原的來(lái)源用于荷載DC。用不同形式的腫瘤細(xì)胞來(lái)源的抗原荷載DC的好處是可以獲得腫瘤細(xì)胞的所有的抗原，但往往也可能造成提呈無(wú)關(guān)抗原或自身抗原，誘導(dǎo)耐受或者自身免疫。但由于壞死的腫瘤細(xì)胞可以釋放大量的HSPs和HMGB1，從而促進(jìn)了DC的成熟，而凋亡的腫瘤細(xì)胞除了釋放HSPs和HMGB1之外，其表面則可以表達(dá)大量的有助于DC吞噬的calreticulin，從而可以有效對(duì)抗腫瘤細(xì)胞來(lái)源的具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的IL-10或者TGF-β的作用。因此，有研究表明，用壞死或者凋亡的腫瘤細(xì)胞荷載的DC確實(shí)可以誘導(dǎo)有效的CTL反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，用腫瘤干細(xì)胞裂解液荷載的DC，比荷載腫瘤細(xì)胞裂解液的DC在小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)，這為腫瘤抗原的獲取提供了新的思路。

3.2誘導(dǎo)DC在體內(nèi)攝取腫瘤抗原

目前主要是利用針對(duì)DC受體的抗體與某一特定抗原形成嵌合蛋白來(lái)達(dá)到在體內(nèi)誘導(dǎo)DC攝取腫瘤抗原的目的，有研究發(fā)現(xiàn)，利用DC表面的內(nèi)吞受體的抗體交聯(lián)抗原，可以比液態(tài)抗原提高DC活化T細(xì)胞的效率100倍以上，從而有效促進(jìn)DC的抗腫瘤效應(yīng)。但需要注意的是，由于不同的DC亞群可以激發(fā)不同的免疫反應(yīng)，因此識(shí)別CD8+DC的CD205抗體和識(shí)別CD8-DC的33D1抗體會(huì)最終激發(fā)不同的抗腫瘤免疫應(yīng)答：CD8+DC可以通過(guò)MHCⅠ類(lèi)分子和MHCⅡ類(lèi)分子提呈抗原；CD8-DC則只能通過(guò)MHCⅡ類(lèi)分子提呈抗原。而且，表達(dá)CD205的DC通過(guò)CD70依賴(lài)的機(jī)制觸發(fā)細(xì)胞免疫，而CD8+33D1+DC通過(guò)經(jīng)典的IL-12依賴(lài)的方式產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。同時(shí)，靶向DC不僅僅局限于運(yùn)送抗原。研究者們也分別檢測(cè)了不同的共刺激信號(hào)結(jié)合抗原后對(duì)DC的效應(yīng)，如dectin1、DC-SIGN、CD40等，這些靶向抗體同時(shí)也促進(jìn)了DC的活化。但需要注意的是，不同的活化信號(hào)會(huì)引起DC功能發(fā)生極化，比如DC-ASGPR會(huì)造成DC分泌IL-10而負(fù)向調(diào)節(jié)DC的抗腫瘤效應(yīng)。

目前看來(lái)，單純DC疫苗雖有療效但仍須改進(jìn)，需要尋找更為合適的腫瘤抗原、更有效地促進(jìn)DC活化的方法或者與其他方法聯(lián)合使用。需要注意的是，若結(jié)合其他療法，需設(shè)計(jì)實(shí)施得法，以保證在促進(jìn)DC抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)，注意檢測(cè)負(fù)向調(diào)節(jié)方面的變化。比如，以往的研究發(fā)現(xiàn)，DC疫苗結(jié)合全身性應(yīng)用IL-2會(huì)造成外周血中Treg比例上升。

4　展望

免疫細(xì)胞治療經(jīng)過(guò)長(zhǎng)足的發(fā)展，已經(jīng)在多種腫瘤的治療上發(fā)揮了很好的療效，給人們帶來(lái)了曙光。然而，如何進(jìn)一步提高療效與特異性，擴(kuò)大適應(yīng)證，是未來(lái)研究的方向。其中，對(duì)于免疫細(xì)胞的工程化修飾如何簡(jiǎn)便可行并具有腫瘤與患者個(gè)體化特點(diǎn)，尚需進(jìn)一步優(yōu)化；進(jìn)一步深入研究免疫細(xì)胞回輸體內(nèi)之后遷移過(guò)程的分子機(jī)制以設(shè)法將其引導(dǎo)至腫瘤部位或者免疫激發(fā)器官，也是值得探索的一個(gè)方向；對(duì)于腫瘤細(xì)胞如何逃逸免疫監(jiān)視與殺傷機(jī)制的深入研究，可以提供更多的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展，篩選生物標(biāo)志物，從而可以預(yù)篩選過(guò)繼細(xì)胞治療可以發(fā)揮作用的腫瘤患者，將對(duì)于腫瘤的免疫細(xì)胞治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。另外，如何將傳統(tǒng)的腫瘤治療方法與現(xiàn)有的免疫細(xì)胞治療相結(jié)合，或者將不同的免疫細(xì)胞療法相結(jié)合，從而達(dá)到最好的療效，仍需要進(jìn)一步的探究。最后，利用健康大數(shù)據(jù)，建立新的免疫細(xì)胞治療的評(píng)價(jià)體系，也顯得非常重要：大量的臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)免疫治療后患者的長(zhǎng)期生存率往往高于客觀(guān)反應(yīng)率，而且，由于在免疫治療早期腫瘤可能會(huì)因?yàn)榱馨图?xì)胞的浸潤(rùn)以及炎癥反應(yīng)而增大，因此，單純檢測(cè)腫瘤大小、腫瘤標(biāo)志物等指標(biāo)不能完全實(shí)際反應(yīng)免疫治療的效應(yīng)，整體生存率可能才是最重要的指標(biāo)，但對(duì)于臨床試驗(yàn)而言，觀(guān)察整體生存率可能會(huì)耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)而且費(fèi)用增加。總之，腫瘤治療是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜、需要不同治療方案協(xié)同進(jìn)行的過(guò)程，更深入了解免疫反應(yīng)的調(diào)控因素，從不同的角度增強(qiáng)免疫細(xì)胞治療的效應(yīng)，將為腫瘤的免疫細(xì)胞治療提供更多途徑。

【作者單位：第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所暨醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室】

（摘自《中國(guó)腫瘤生物治療雜志》2016年第2期）