付娟娟　龐　峰　李艷華　咸慶杰　李波清

?

肺炎克雷伯菌ESBLs基因型分布與耐藥相關(guān)性研究

付娟娟1，2龐峰2李艷華2咸慶杰2李波清1

【摘要】目的 研究聊城地區(qū)呼吸道感染患者中產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌相關(guān)耐藥基因的分型及不同基因型與抗生素耐藥性關(guān)系。方法 收集2015年10～12月本院137例肺炎克雷伯菌陽性痰標本，比較分析基因型對抗生素的耐藥性的關(guān)系。結(jié)果 產(chǎn)ESBLs菌株對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟和氨曲南的耐藥率與非ESBLs菌株相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；CTX-M型陽性菌株與陰性菌株相比，對抗生素頭孢曲松、頭孢噻肟和氨曲南耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0．05）；SHV型陽性菌株與陰性菌株相比，對抗生素頭孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論 通過檢測肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)ESBLs酶和ESBLs基因，分析ESBLs基因本院流行情況及常見基因與抗生素耐藥關(guān)系，為指導(dǎo)臨床醫(yī)師合理用藥提供可靠依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】呼吸道細菌感染；肺炎克雷伯菌；抗生素

作者單位： 1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003；2 聊城市人民醫(yī)院檢驗科，山東 聊城 252000

近年來，隨著抗生素的大量不規(guī)范使用，特別是β內(nèi)酰胺類抗生素、免疫抑制劑、腫瘤化療等藥物的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌日趨增多，由于各地區(qū)、各醫(yī)院抗菌藥物使用情況差異較大，產(chǎn)ESBLs菌株的流行情況和基因型的分布亦存在較大差異［1］。本研究以2015年10～12月本院137例肺炎克雷伯氏菌陽性痰標本作為研究對象，探究其肺炎克雷伯菌的產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率、耐藥性情況、基因型分布及不同基因型ESBLs與抗生素耐藥性的關(guān)系等問題，旨在得出更為全面的克雷伯菌的ESBLS基因分型及耐藥性情況，為后續(xù)的耐藥性監(jiān)測、醫(yī)院感染控制、臨床抗感染用藥等方面提供良好的研究依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 選取本院2015年10～12月收治的呼吸道感染患者中痰標本培養(yǎng)出肺炎克雷伯菌的137例患者作為研究對象，收集這137株肺炎克雷伯菌菌株作為試驗菌株。

1.1.2試劑 抗生素紙片、MH肉湯培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基（廣州迪景）；AST-GN13藥敏卡（法國梅里埃）；ESBLs耐藥基因TEM、CTX-M和SHV引物均由上海的英駿合成提供；小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（QIAGEN公司）。

1.1.3儀器 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)；Thermo Forma 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱；Gene Amp PCR System 9700；Bio-rad核酸電泳儀等。

1.2方法

1.2.1VITEK 2-compact全自動分析系統(tǒng)檢測初篩ESBLs陽性菌株將臨床分離菌株嚴格參照GNI鑒定卡、AST-GN 13藥敏卡說明書要求操作，利用VITEK 2-compact全自動分析系統(tǒng)進行檢測。儀器檢測AST-GN 13藥敏卡的ESBLs 6個檢測孔（頭孢噻肟與頭孢噻肟+棒酸、頭孢他啶與頭孢他啶+棒酸、頭孢吡肟與頭孢吡肟+棒酸）的生長濁度變化加棒酸的孔細菌生長濁度減少50％或以上，判定為ESBLs陽性；將篩選出ESBLs陽性菌株-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙紙片表型確證試驗 雙紙片擴散法確證試驗確定ESBLs陽性菌株，結(jié)果判斷標準參照CLSI文件M100-S23（2013年）推薦的標準。以大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌 ATCC700603為標準質(zhì)控菌株。

1.2.3ESBLs陽性菌株DNA的提取 將確定的ESBLs陽性菌株從-20℃冰箱取出，刮取少量菌液接種于l ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫過夜；將過夜培養(yǎng)的1 ml菌液置于1.5 ml Eppendof管中，采用德國QIAGEN公司的小量質(zhì)粒提取試劑盒，操作過程嚴格按照說明書進行，將產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用列聯(lián)表統(tǒng)計分析工具V1處理數(shù)據(jù)，率采用χ2檢驗或精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株的檢出情況

137例肺炎克雷伯菌陽性菌株中，VITEK MS和VITEK2 COMPACT全自動分析系統(tǒng)上機檢測ESBLs陽性菌株43株，雙紙片擴散法確證試驗亦是43株ESBLs陽性菌株，檢出率32.1％。

2.2耐藥性

產(chǎn)ESBLs菌株對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟和氨曲南的耐藥率分別是46.51％、65.12％、62.79％、37.21％和 69.77％，與非ESBLs菌株（25.53％、36.17％、15.96％、19.15％和25.53％）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs菌株相比，均對美羅培南、亞胺培南、厄他培南、頭孢替坦和阿米卡星比較敏感，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；產(chǎn)ESBLs菌株對氨芐西林耐藥率為100％，非產(chǎn)ESBLs菌株對氨芐西林耐藥率為98.94％，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其他抗菌藥物，產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs菌株相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3PCR檢測結(jié)果

TEM基因擴增產(chǎn)物在電泳圖上在1 094 bp左右見圖2；SHV基因擴增片段在865 bp左右見圖3；CTX-M基因擴增片段在814 bp左右。

2.4確認基因分型

經(jīng)表型試驗確認有43株產(chǎn)ESBLs陽性菌株，TEM、SHV和CTX-M基因擴增產(chǎn)物陽性株有42株，1株為陰性。42株陽性株檢出CTX-M型36株，SHV型26株、TEM型6株、TEM 和SHV復(fù)合型2株、CTX-M和SHV復(fù)合型10株、CTX-M、SHV和TEM復(fù)合型1株。

2.5不同耐藥相關(guān)基因型對抗生素的耐藥率分析

在137株肺炎克雷伯氏菌菌株中，CTX-M型36株（6.3％），SHV型26株（19.0％），TEM型6株（4.4％）；CTX-M型陽性菌株與CTX-M型陰性菌株相比，對頭孢曲松（72.22％ vs.35.64％）、頭孢噻肟（61.11％vs.19.80％）和氨曲南（72.22％ vs.27.72％）耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SHV陽性與SHV陰性菌株相比，對頭孢他啶（61.54％ vs 25.23％）和哌拉西林/他唑巴坦（50.00％ vs.17.12％）耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TEM陽性與TEM陰性菌株相比，對頭孢他啶（83.33％ vs.29.77％）耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在其他抗生素（美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦等）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

CTX-M型陽性菌株對頭孢噻肟耐藥的菌株占61.1％，而對頭孢他啶耐藥的菌株僅占30.6％；相反，SHV型陽性菌株對頭孢他啶耐藥的菌株占61.5％，對頭孢噻肟耐藥的菌株僅占46.2％，TEM型陽性菌株對頭孢他啶耐藥的菌株占83.3％，孢噻肟耐藥的菌株僅占33.3％；對抗生素頭孢曲松耐藥率，CTX-M型陽性菌株（72.2％）高于SHV型陽性菌株，高于TEM型陽性菌株。

3　討論

由于臨床抗生素廣泛使用，三代頭孢的耐藥率及產(chǎn)ESBLs的菌株檢出率逐年增高，在美國，不同醫(yī)院中腸桿菌科細菌ESBLs的檢出率為0％～25％，平均為3％，在國內(nèi)，據(jù)劉露報道［2-4］我國11個地區(qū)肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs檢出率為17.6％～60％，本次研究從吸道疾病患者痰標本中選取肺炎克雷伯菌陽性菌137株，通過VITEK2 COMPACT全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)上機檢測初篩ESBLs陽性菌株43株，雙紙片擴散法試驗確證ESBLs陽性菌株43株，檢出率為32.1％，提示產(chǎn)ESBLs菌株流行情況已經(jīng)很嚴重。

經(jīng)表型確證試驗確認有43株產(chǎn)ESBLs陽性肺炎克雷伯菌菌株，而TEM、SHV和CTX-M基因擴增產(chǎn)物陽性株有43株，1株為陰性。陰性菌株重復(fù)3次表型確證試驗和3次TEM、SHV和CTX-M基因擴增，結(jié)果表型確證試驗依然陽性，而擴增依然陰性。研究表明，這43株產(chǎn)ESBLs陽性菌株中有一株ESBLs基因型是除外TEM、SHV和CTX-M基因的其他基因型。產(chǎn)ESBLs菌株在臨床上的流行情況因地域差別有所不同，不同地區(qū)基因型的分布亦存在較大差異［5-6］。本次研究本地區(qū)流行的ESBLs基因型以CTX-M和SHV型為主，另外，有10株存在CTX-M和SHV型，2株存在TEM和SHV型，1株存在CTX-M、SHV和TEM型，原因可能細菌質(zhì)粒上同時攜帶兩種或者三種ESBLs編碼基因［7-8］。

對頭孢噻肟耐藥率低于對頭孢他啶說明本地區(qū)SHV基因型ESBLs還是以頭孢他啶酶為主。比較CTX-M與SHV型ESBLs對抗生素的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)，兩基因型均對美羅培南、亞胺培南等碳青霉烯類抗生素比較敏感；均對阿米卡星和頭孢替坦保持比較高的敏感性；對第三代頭孢菌素耐藥率：CTX-M型ESBLs對頭孢噻肟的耐藥率遠高于頭孢他啶，SHV型ESBLs對頭孢他啶的耐藥率遠高于頭孢噻肟；對頭孢曲松耐藥都很高；對部分第四代頭孢菌素耐藥率升高，如頭孢吡肟；ESBLs通常為質(zhì)粒介導(dǎo)，質(zhì)粒很容易在不同細科之間傳播，累積多種耐藥基因，從而使細菌的質(zhì)粒攜帶多種耐藥基因，造成細菌產(chǎn)生多重耐藥。所以針對本地區(qū)的呼吸道感染患者，不要盲目使用抗生素，盡量待藥敏結(jié)果出來，根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗生素，如果經(jīng)驗性治療，盡量避免使用青霉素類、三代頭孢菌素和氨曲南，可選用碳青霉烯類抗生素、阿米卡星和頭孢替坦等藥物；盡量避免抗生素的過度和不合理使用而導(dǎo)致多重耐藥的產(chǎn)生，控制耐藥菌株的擴散和流行。

參考文獻

［1］倪小清，姬小麗，劉小康． 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的耐藥性分析及TEM基因測序［A］． 中國藥理學(xué)會第十一屆全國化療藥理學(xué)術(shù)研討會論文集［C］． 北京：中國藥理學(xué)會化療藥理專業(yè)委員會，2012．

［2］劉露，陳國強． 全國11個地區(qū)肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及其耐藥性分析［J］． 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15（9）：1064-1066．

［3］邱星安． 肺炎克雷伯菌的耐藥趨勢及耐藥機制的研究進展［J］．中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5（5）：236-238．

［4］張新明，陳連平，涂斐佩． 肺炎克雷伯菌ESBLs及AmpC酶的基因分布檢測與耐藥特性的相關(guān)性研究［J］． 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26（9）：1084-1087．

［5］涂斐佩，張新明，吳海鷗． 瑞安地區(qū)肺炎克雷伯菌ESBLs及AmpC β-內(nèi)酰胺酶的基因分布與耐藥特性的相關(guān)性研究［J］．中國抗生素雜志，2015，40（4）：274-277．

［6］聶慶東，張秀梅，孫宇峰，等． 老年呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐藥監(jiān)測及產(chǎn)ESBLs基因型分析［J］． 中國老年學(xué)雜志，2012，32（13）：2727-2729．

［7］葉惠芬，陳惠玲，劉平，等． 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性和基因型分布［J］． 中國感染與化療雜志，2007，7（2）：127-129．

［8］陳聰． 40株P(guān)MQR基因陽性大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs流行特征的研究［D］． 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2013：11-12．

·臨床研究·

Study on the Relationship Between ESBLs Genotype Distribution and Drug Resistance of Klebsiella Pneumoniae

FU Juanjuan1，2PANG Feng2LI Yanhua2XIAN Qingjie2LI Boqing11 Department of Basic Medical Sciences， Binzhou Medical University， Yantai

Shandong 264003， China， 2 Department of Laboratory， Liaocheng People′s Hospital， Liaocheng Shandong 252000， China

［Abstract］Objective To study the genotype and antibiotic resistance of ESBLs Klebsiella pneumoniae in patients with respiratory tract infections in Liaocheng area. Methods Collected 137 cases of Klebsiella pneumoniae positive sputum samples from October to December 2015 in our hospital，and analyzed the relationship between genotype and antibiotic resistance. Results The ESBLs producing strains to ceftazidime， ceftriaxone，cefotaxime， cefepime and aztreonam resistance rate compared with non ESBLs strains， the difference was statistically significant （P＜0.05）， type CTX-M positive strains compared with negative strains in ceftriaxone，cefotaxime and aztreonam resistance rate significantly the difference of antibiotic （P＜0.05）， type SHV positive strains compared with negative strains， antibiotic ceftazidime and piperacillin / tazobactam resistance rate was significantly difference （P＜0.05）. Conclusion The detection of Klebsiella pneumoniae producing ESBLs enzyme and ESBLs gene，ESBLs gene analysis of the epidemic situation and the common genes and antibiotic resistance， and provide a reliable basis for guiding the rational drug use.

［Key words］Bacterial infection of respiratory tract， Klebsiella pneumonia，Antibiotic

【中圖分類號】R978．1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）12-0111-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．12．080

通訊作者：李波清，E-mail：sdliboqing@163．com