盛廣濟(jì) 朱 君 樊瑜波 李 昂

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

集成化熒光激活液滴分選系統(tǒng)研究

盛廣濟(jì) 朱 君 樊瑜波#李 昂*

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

高通量的熒光激活液滴分選技術(shù)在大規(guī)模生化試驗(yàn)中能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，因此在微生物菌株篩選、新藥研發(fā)、高通量單細(xì)胞研究等眾多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。然而，目前使用的熒光激活液滴分選系統(tǒng)大多基于光學(xué)試驗(yàn)器件搭建，系統(tǒng)的靈活性、穩(wěn)定性相對較差，搭建的技術(shù)門檻較高，限制了該技術(shù)在生命科學(xué)研究等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。設(shè)計(jì)一種集成化的熒光激活液滴分選系統(tǒng)，通過特定光路設(shè)計(jì)，系統(tǒng)所需的熒光激發(fā)和探測光路實(shí)現(xiàn)集成化、模塊化封裝，熒光激發(fā)和探測功能模塊縮小到160 mm×143 mm×54 mm，大幅縮減系統(tǒng)體積?？梢酝ㄟ^給普通顯微鏡增加功能模塊的方式，快速實(shí)現(xiàn)分選系統(tǒng)的搭建，從而提高熒光激活液滴分選技術(shù)的易用性。相比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的熒光激活液滴分選系統(tǒng)，成本下降到1/5，體積減小為1/40，有利于該技術(shù)的工業(yè)化推廣。

熒光激活；液滴分選；集成化

fluorescence activated; droplet sorting; system integration

引言

微流控技術(shù)能夠在很小的尺度上精細(xì)地操作流體的運(yùn)動(dòng)，配合特殊設(shè)計(jì)的芯片，能夠在片上實(shí)現(xiàn)從樣品的制備、孵育到反應(yīng)產(chǎn)物的純化、分析等一系列操作[1-2]，因而催生了片上實(shí)驗(yàn)室的概念。該技術(shù)能夠大大簡化傳統(tǒng)生化試驗(yàn)流程，降低實(shí)驗(yàn)試劑的消耗，提高試驗(yàn)的自動(dòng)化程度，近年來得到了廣泛關(guān)注。在微流控技術(shù)中，依據(jù)反應(yīng)體系的存在形式，可以分為連續(xù)流體體系和微液滴體系。其中，微液滴反應(yīng)體系是在特殊設(shè)計(jì)的微流控芯片中，利用水在油相中的乳化效應(yīng)，將反應(yīng)體系分割成為相互隔離的微小液滴。液滴在油相中懸浮，在表面活性劑的作用下能夠穩(wěn)定存在。目前，微液滴的生成、融合和液滴可控注入等操作都相對成熟，操作的通量高達(dá)每秒鐘103個(gè)液滴[3]，因此能夠滿足高通量實(shí)驗(yàn)的需求。

微液滴實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有的高通量、超小反應(yīng)體系等突出特點(diǎn)，使得該技術(shù)在菌株篩選、藥物研發(fā)、高通量單細(xì)胞研究、微量樣品富集等眾多領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[4-6]。尤其是近年來，以伯樂(Biorad)為代表的微液滴數(shù)字PCR技術(shù)能夠?qū)鹘y(tǒng)PCR技術(shù)的探測靈敏度大大提高，在癌癥的早期診斷、測序文庫制備等領(lǐng)域都具有極高的應(yīng)用價(jià)值[7]。

但是，目前微液滴技術(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作平臺(tái)。其中，液滴的生成、融合、再注入等操作相對簡單，研究人員配合特定的微流控芯片能夠較簡單地完成，但對于液滴的分析以及特定目標(biāo)的高通量篩選操作非常復(fù)雜。試驗(yàn)系統(tǒng)包括復(fù)雜的熒光激發(fā)、探測以及高壓介電篩選等組成部分，雖然已有文獻(xiàn)對熒光激活液滴分選系統(tǒng)(fluorescence activated droplet sorting system, FADS)搭建方法進(jìn)行了報(bào)道[8]，但自行搭建系統(tǒng)對研究人員的技術(shù)要求極高，現(xiàn)有的系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)方案復(fù)雜，集成化難度大，維護(hù)成本高，目前市場上還沒有相應(yīng)的產(chǎn)品出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的缺失，很大程度地限制了FADS的發(fā)展[9-10]。

本研究基于熒光激活液滴分選技術(shù)，提出了集成化FADS解決方案。該方案將熒光激發(fā)、多通道熒光探測光路巧妙地與成像光路相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了FADS的集成化、模塊化。實(shí)驗(yàn)人員搭建FADS只需為顯微鏡安裝相應(yīng)的功能模塊，無需復(fù)雜的光路調(diào)整和優(yōu)化。同目前見諸文獻(xiàn)報(bào)道的系統(tǒng)相比，該方案具有體積小、成本低、熒光探測靈敏度高、使用方便等顯著特點(diǎn)，對熒光激活液滴分選技術(shù)的推廣具有一定的推動(dòng)作用。

1 系統(tǒng)原理與設(shè)計(jì)

1.1 FAD原理

熒光激活液滴分選技術(shù)首先將樣品分成相互隔絕、大小均一的微液滴，每一微液滴構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)器(單分散性)。如圖1所示，生成的液滴通過孵育培養(yǎng)后，包含目標(biāo)產(chǎn)物的陽性液滴和液滴中包裹的標(biāo)記物反應(yīng)，從而產(chǎn)生特定的熒光信號(hào)。當(dāng)該陽性液滴混雜在大量陰性液滴中依次高速通過FADS的熒光檢測區(qū)域時(shí)，熒光信號(hào)超過設(shè)定分選閾值，觸發(fā)分選高壓，從而在高壓介電電泳力的作用下被篩選到特定的流體通道，實(shí)現(xiàn)陽性液滴的富集[1-3]。

圖1 FADS工作原理Fig.1 Fluorescence activated droplet sorting system

1.2 FADS組成

FADS包括液滴熒光激發(fā)模塊、熒光探測模塊和高壓分選模塊。其中，熒光激發(fā)模塊和熒光探測模塊涉及光路的搭建，光路的設(shè)計(jì)也決定FADS系統(tǒng)的使用靈活性、可維護(hù)性以及信號(hào)探測質(zhì)量的好壞。

目前，研究人員多基于熒光顯微鏡搭建光路系統(tǒng)[11]。激光光路和熒光探測光路在顯微鏡內(nèi)由二向色片合束，通過顯微物鏡聚焦于微流控芯片的熒光探測位置(見圖2)。

圖2 基于熒光顯微鏡光路搭建的FADSFig.2 Configuration of FADS based on fluorescence microscope

通常，為了減小探測熒光的背景噪聲，需要在光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)前安裝小孔，防止微流控芯片中熒光探測位置以外的干擾信號(hào)進(jìn)入PMT。光路要求小孔的位置與激光激發(fā)位置在顯微鏡像平面的像重合，大小和激光光斑的像大小相等。小孔大小通常在10～100 μm，因此對小孔的位置和大小調(diào)整要求極其精確[8]。又因?yàn)樾】孜挥跓晒夤饴分?，通常熒光信?hào)很弱，肉眼不可見，因此調(diào)整難度很高。

另外，由于激光光路和熒光探測光路是分離的，如果激發(fā)光光束位置稍有變化，會(huì)造成熒光探測位置在顯微鏡像平面的像與小孔位置偏離，從而造成熒光探測效率降低，因此這種設(shè)計(jì)往往需要經(jīng)常校準(zhǔn)小孔的位置來保證系統(tǒng)熒光探測效率，系統(tǒng)維護(hù)復(fù)雜。

為了解決該問題，配合顯微成像系統(tǒng)光路，設(shè)計(jì)FADS的熒光激發(fā)和探測模塊(見圖3)。顯微鏡光路能夠?qū)悠吠队暗较衿矫?，形成清晰的像，如果在該像平面處安裝小孔，就會(huì)形成一個(gè)激光激發(fā)和熒光探測的共用窗口。激光聚焦于小孔位置形成光斑，在顯微鏡光路作用下，投影到微流控芯片熒光探測位置，該位置激發(fā)出的熒光在小孔所在位置成像，最終被PMT接收。

圖3 集成化FADS功能模塊與顯微鏡配合Fig.3 Configuration of FADS based on integration FADS functional module

這種設(shè)計(jì)能夠保證小孔處透過激光激發(fā)的熒光必然返回小孔處以形成熒光信號(hào)，而小孔位置以外的背景雜光則能夠被完全阻擋。這種光路設(shè)計(jì)能夠保證激光激發(fā)和熒光探測達(dá)到最高效率，相當(dāng)于能夠自動(dòng)保證常規(guī)光路設(shè)計(jì)條件下小孔位置始終處于理論最優(yōu)位置，熒光信號(hào)的信噪比始終保持在最高水平。當(dāng)激光光腰直徑略大于小孔孔徑時(shí)，即使小孔的位置稍有偏移，對熒光激發(fā)和探測不會(huì)造成影響，從而大大降低了系統(tǒng)的維護(hù)難度。另外，由于激光模塊和熒光探測模塊在光路中處在同一位置，因此能夠方便地將該部分進(jìn)行封裝，從而形成完整的FADS功能模塊，稱之為FADS功能模塊。該模塊內(nèi)光路一旦調(diào)整完成，就無需在后續(xù)的使用中調(diào)整。模塊可以配合任意成像設(shè)備，如正置顯微鏡、倒置顯微鏡、體式顯微鏡，甚至微距鏡頭組成FADS。科研人員能夠靈活地將熒光激活液滴分選技術(shù)集成到現(xiàn)有試驗(yàn)系統(tǒng)中(如雙光子顯微鏡、拉曼顯微鏡等)，組成復(fù)雜的微流控分析分選平臺(tái)。

1.3 模塊集成化

圍繞成像系統(tǒng)像平面設(shè)計(jì)小孔位置，激光和熒光經(jīng)過同一小孔位置進(jìn)入成像系統(tǒng)，這種設(shè)計(jì)能夠方便地將熒光探測光路和激光光路進(jìn)行緊湊的整合，從而實(shí)現(xiàn)FADS的集成化、模塊化設(shè)計(jì)。圖4展示了FADS集成化設(shè)計(jì)之后的功能擴(kuò)展模塊，其中包含激光器、三通道熒光探測PMT、PMT高壓電源、24位精密模數(shù)轉(zhuǎn)換電路，以及分選高壓觸發(fā)輸出控制單元。模塊尺寸為160 mm×143 mm×54 mm，相對在光學(xué)平臺(tái)上搭建的FADS體積明顯縮小。另外，模塊全密封設(shè)計(jì)，使得系統(tǒng)的抗干擾能力增強(qiáng)，熒光信號(hào)探測質(zhì)量得到很大提高。

圖4 FADS功能模塊內(nèi)部組成Fig.4 Component in FADS functional module

2 系統(tǒng)測試

將集成化FADS功能模塊安裝到倒置熒光顯微鏡拍照接口上，能夠快速搭建FADS(見圖5)。本研究設(shè)計(jì)了系統(tǒng)測試芯片，測試FADS的熒光探測靈敏度、信噪比、分選通量，以及分選正確率。

圖5 采用集成化設(shè)計(jì)方案搭建的FADS(A為FADS功能模塊，實(shí)現(xiàn)熒光的激發(fā)和探測；B為超高速相機(jī)，實(shí)現(xiàn)對液滴生成及分選過程的觀察；C為FADS電源模塊，負(fù)責(zé)系統(tǒng)的供電；D為FADS高壓分選模塊，負(fù)責(zé)產(chǎn)生液滴分選所需的千伏高頻電壓)Fig.5 FADS build with integrated functional modules (A: FADS functional module, used for fluorescence activation and detection; B: Ultra-high speed camera, used for droplet generation and sorting real-time observation; C: FADS system power module, used for power up the system. D: FADS system high voltage generation module, used for generating high frequency high voltage AC signal to sorting positive droplet)

芯片設(shè)計(jì)如圖6所示，片上實(shí)現(xiàn)兩路液滴生成，一路生成包含轉(zhuǎn)染了GFP大腸桿菌的液滴作為陽性液滴，另一路生成空液滴作為陰性對照，液滴體積約50 pL。生成的液滴匯流到一個(gè)通道中，陽性液滴與陰性液滴依次間隔排列。最后，液滴依次通過熒光檢測通道，通過FADS功能模塊讀取液滴的熒光強(qiáng)度信號(hào)，當(dāng)強(qiáng)度超過設(shè)定的分選閾值后，給出分選觸發(fā)信號(hào)，觸發(fā)高壓分選，從而將陽性液滴分選到上方通道，完成陽性液滴的富集。

圖6 用于驗(yàn)證FADS的微流控芯片(A,B為液滴生成;C為液滴匯流；D為液滴加速，擴(kuò)大液滴間距離；E為熒光探測，液滴分選)Fig.6 Microfluidic chips used for FADS testing (A, B: generate droplet; C: positive and negative droplet converge; D: speed up droplet; E: fluorescence detection and droplet sorting)

3 結(jié)果

微流控芯片中液滴生成通量在每通道100～200個(gè)/s時(shí)，液滴的生成、匯流排列、液滴加速分離、熒光激活分選都能夠?qū)崿F(xiàn)(見圖7)。陽性液滴的熒光信號(hào)能夠很好地和陰性液滴區(qū)分開，并成功地實(shí)施分選，液滴的分選正確率為100%(通過超高速相機(jī)檢測了20 000個(gè)液滴的分選過程)。當(dāng)液滴生成通量進(jìn)一步提高時(shí)，設(shè)計(jì)的微流控芯片陰性陽性液滴匯流處無法保證陽性液滴陰性液滴依次排列，因此無法校驗(yàn)后端FADS分選結(jié)果的正確性。

圖7 FADS功能測試試驗(yàn)。(a)液滴生成；(b)陽性液滴陰性液滴匯流依次排列;(c)加速液滴;(d)液滴分選Fig.7 Experiment for testing FADS. (a)Generating droplet; (b) Positive and negative droplet converge;(c)Speed up droplet;(d)fluorescence detection and droplet sorting

將熒光信號(hào)導(dǎo)出陽性液滴的信號(hào)強(qiáng)度AD轉(zhuǎn)換結(jié)果為2 829 260，背景噪聲RMS=751.455，對應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度Vs=971.38 mV，背景噪聲強(qiáng)度Vn=258 μV，探測系統(tǒng)的信噪比SNR=79.7 dB。PMT的探測靈敏度約為750 V/nW，可得系統(tǒng)的熒光探測下限為3.5 fW。取熒光信號(hào)波長λ=532 nm，系統(tǒng)能夠探測到的熒光強(qiáng)度下限約為104光子/s，系統(tǒng)的AD采樣速率為10 kHz，則在一次采樣周期內(nèi)(100 μs)，液滴熒光信號(hào)只要有不小于2個(gè)光子進(jìn)入到系統(tǒng)中就能夠被探測到，熒光探測靈敏度接近單光子探測水平(見圖8)。

圖8 FADS熒光信號(hào)探測性能。(a)FADS導(dǎo)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度(b)FADS的噪聲水平Fig.8 FADS fluorescence detection performance. (a) Fluorescence signal output by FADS (b) Noise level of FADS

4 討論

在試驗(yàn)中，測試了集成化功能模塊搭建的FADS，系統(tǒng)對含有GFP熒光轉(zhuǎn)染的大腸桿菌的陽性液滴進(jìn)行了可靠的分選。目前，實(shí)現(xiàn)通量能達(dá)到200液滴每秒，分選的通量主要受限于微流控芯片。系統(tǒng)熒光探測下限可以達(dá)到2個(gè)光子，理論上分選通量能夠達(dá)到采樣率的1/4，約2 500滴/s。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，陰性液滴也會(huì)產(chǎn)生一定的熒光信號(hào)，該信號(hào)將成為系統(tǒng)的重要干擾因素。因此，F(xiàn)ADS的液滴分選通量受限于實(shí)驗(yàn)體系、微流控芯片設(shè)計(jì)，以及FADS等多方面的因素。

采用FADS功能模塊集成化設(shè)計(jì)、熒光激發(fā)和探測光路，以及PMT信號(hào)的模數(shù)轉(zhuǎn)換電路，可以集成到180 mm×143 mm×54 mm大小的功能模塊中；而采用分立的光學(xué)試驗(yàn)組件搭建的FADS[8]，光路部分尺寸為600 mm×800 mm×130 mm。因此，本研究提出的FADS功能模塊集成化設(shè)計(jì)方法，能夠有效減小FADS的體積。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用通用儀器搭建的FADS成本約為28萬元[8]，而搭建本研究提出的集成化FADS硬件成本約為5萬元，系統(tǒng)的搭建成本大幅降低。

采用集成化FADS功能模塊搭建FADS，熒光激發(fā)、熒光探測光路緊湊地集成在一個(gè)功能附件中。一方面，系統(tǒng)搭建無需對光學(xué)組件進(jìn)行復(fù)雜的調(diào)整工作，只需為顯微成像系統(tǒng)增添功能附件；另一方面，由于熒光激發(fā)光路和熒光探測光路集成在同一模塊中，系統(tǒng)無需頻繁地調(diào)整光路來減少由于光路失調(diào)對熒光探測效率的影響，降低了系統(tǒng)維護(hù)難度。

本研究提出的集成化FADS，在降低系統(tǒng)成本、減小系統(tǒng)體積的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)核心敏感組件的模塊化封裝、系統(tǒng)的模塊化搭建，為FADS的推廣提供了一個(gè)可行的解決方案。

目前，搭建的FADS分選判斷依據(jù)是液滴熒光信號(hào)強(qiáng)度是否超過設(shè)定閾值。當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度超過設(shè)定閾值時(shí)，判定液滴為陽性，觸發(fā)高壓分選，否則為陰性，系統(tǒng)不動(dòng)作。這種方式簡單高效，但是在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，熒光探測系統(tǒng)輸出常伴有尖峰狀噪聲，如果單純根據(jù)強(qiáng)度閾值來判斷，容易造成假陽性結(jié)果。如果能夠引入“過閾值時(shí)間”判斷標(biāo)準(zhǔn)，即熒光強(qiáng)度超過閾值的時(shí)間達(dá)到一定長度才判定當(dāng)前信號(hào)有效，則能夠避免尖峰噪聲造成的系統(tǒng)假陽性錯(cuò)誤，從而進(jìn)一步提高系統(tǒng)的可靠性。另外，本研究提出的FADS系統(tǒng)集成了3個(gè)熒光探測通道，如何綜合三通道熒光強(qiáng)度來給出陽性液滴的判斷條件較為復(fù)雜。3個(gè)熒光探測通道分別設(shè)置3個(gè)對應(yīng)的閾值，最終的判斷結(jié)果等于三通道獨(dú)立判斷結(jié)果的布爾運(yùn)算。這種方式適用于采用的熒光標(biāo)記物發(fā)射熒光波長能夠較好地匹配探測波長，即單一標(biāo)記物熒光波長與特定探測通道波長相匹配。如圖9(a)所示，標(biāo)記物發(fā)射熒光能夠被單一通道探測，沒有出現(xiàn)明顯混疊。當(dāng)標(biāo)記物熒光光譜較寬或者發(fā)射波長位于兩個(gè)探測通道之間時(shí)，熒光信號(hào)分布于多個(gè)探測通道中，從而造成單一標(biāo)記物引發(fā)兩個(gè)通道熒光信號(hào)超過閾值。當(dāng)微液滴中包裹了多種熒光標(biāo)記物時(shí)，系統(tǒng)的陽性判斷就會(huì)出現(xiàn)混亂。系統(tǒng)無法對單一標(biāo)記物的陽性、陰性結(jié)果做出準(zhǔn)確的判斷。如何實(shí)現(xiàn)多種熒光標(biāo)記物同時(shí)存在于復(fù)雜反應(yīng)體系中，通過三通道熒光探測結(jié)果準(zhǔn)確分辨某一熒光標(biāo)記物在多通道熒光檢測FADS中至關(guān)重要。另外，由于FADS要求從熒光檢測到做出分選判斷時(shí)間延遲足夠小(通常小于1 ms),從而滿足分選通量的要求，因此對算法的實(shí)時(shí)性要求較高。該穩(wěn)定算法的開發(fā)，以及如何實(shí)現(xiàn)在嵌入式系統(tǒng)中實(shí)時(shí)運(yùn)行優(yōu)化，是下一步多通道探測FADS系統(tǒng)研究的重點(diǎn)。

5 結(jié)論

本研究提出了一種集成化設(shè)計(jì)的FADS功能模塊，相對于目前文獻(xiàn)中報(bào)道的系統(tǒng)具有體積小、成本低、易于維護(hù)等特點(diǎn)。另外，本研究提出基于成像系統(tǒng)像平面設(shè)計(jì)熒光激發(fā)和探測光路的方法，能夠有效地將FADS集成化，封裝成獨(dú)立的拓展功能模塊。使用該模塊，可以在成像設(shè)備的基礎(chǔ)上，靈活地拓展熒光激活液滴分選功能。實(shí)驗(yàn)表明，使用該模塊搭建FADS，能夠穩(wěn)定可靠地實(shí)現(xiàn)200液滴/s的分選通量，并且理論上仍具有很大的提升空間，對熒光激活液滴分選技術(shù)的推廣具有重要意義。

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10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 03.016

2015-10-19， 錄用日期:2016-02-26

R318

D

0258-8021(2016) 03-0370-05

Research on Integrated Fluorescence Activated Droplet Sorting System

Sheng Guangji Zhu Jun Fan Yubo#Li Ang*

(SchoolofBiomedicalScienceandMedicalEngineeringBeihangUniversity,Beijing100191,China)

# 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)會(huì)員(Member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:eangli@yahoo.com