鐘少杰，何春梅，林 誠

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 350013)

響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英總黃酮提取工藝

鐘少杰，何春梅，林 誠

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 350013)

為確定紫云英總黃酮乙醇提取的最佳工藝條件，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：提取紫云英總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度31%、液料比41、提取溫度73℃、提取時間106 min，總黃酮提取率為3.698%，與預(yù)測值相對誤差為0.4%。

紫云英；總黃酮；提取工藝

紫云英又名翹搖、紅花草、草子，屬豆科、黃芪屬，作為綠肥近年在南方稻田恢復(fù)種植，以培肥地力、替代傳統(tǒng)化肥。紫云英除肥田以外，可作飼草、可作蔬菜、可入藥、可觀賞，還是重要的蜜源植物，具有較強(qiáng)的富硒能力，對開發(fā)高附加值農(nóng)產(chǎn)品意義重大。

黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、降血糖、降血脂、抗氧化等多種生理活性，廣泛存在于植物體中[1-2]。目前對紫云英總黃酮提取工藝的研究較少，本研究采用紫外分光光度法測定紫云英總黃酮含量，應(yīng)用浸提法對紫云英總黃酮提取進(jìn)行研究，采用響應(yīng)面法考察紫云英總黃酮的提取工藝中各因素對提取效果的影響，為紫云英的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

攪拌機(jī)MJ-BL25C3(美的)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，數(shù)顯恒溫油浴鍋(國華電器有限公司)，xMark酶標(biāo)儀(BioRad公司)，蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)，無水乙醇(AR，西隴化工股份有限公司)，亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純。

供試紫云英品種為閩紫7號。

1.2 試驗方法

1.2.1 比色法測定總黃酮含量 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[3]測定紫云英總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測定510 nm處的吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。

紫云英提取的待測液采用上述方法測定，測得的吸光度值代入線性回歸方程，得到紫云英總黃酮質(zhì)量濃度，通過公式(1)計算得總黃酮的提取率：

總黃酮提取率=(b×V)/(m×103)

(1)

式中，V：提取液體積(L)；m：紫云英的質(zhì)量(g)；b：按照線性回歸方程計算出的總黃酮質(zhì)量濃度(mg/g)。

1.2.2 紫云英總黃酮提取工藝 紫云英用清水洗凈，再用蒸餾水泡洗，50℃恒溫烘干，粉碎，過60目篩，密封干燥保存，備用。準(zhǔn)確稱取一定量的紫云英粉末于燒瓶中，水浴恒溫，根據(jù)設(shè)計的工藝條件，進(jìn)行紫云英總黃酮提取，按1.2.1試驗方法測定紫云英總黃酮提取質(zhì)量，根據(jù)公式(1)計算總黃酮提取率。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗 對提取溫度、液料比、乙醇濃度和提取時間4個主要因素進(jìn)行優(yōu)化，研究各因素對紫云英總黃酮提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用Design Expert 8.05b軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，以紫云英總黃酮提取率為響應(yīng)值，考察提取溫度(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取時間(D)及各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 紫云英黃酮提取響應(yīng)面分析因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響

2.1.1 提取溫度 在液料比40、乙醇濃度30%和提取時間100 min的條件下，不同提取溫度處理(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)對紫云英總黃酮提取率影響結(jié)果如圖1A所示。在70℃時，總黃酮提取率最高；當(dāng)溫度高于70℃時，總黃酮提取率開始下降。究其原因可能是溫度越高，分子熱運動越激烈，乙醇分子與紫云英中的黃酮類物質(zhì)碰撞次數(shù)越多，黃酮類物質(zhì)溶出量越多，提取率就越高；當(dāng)溫度超過70℃時，紫云英總黃酮中的一些不穩(wěn)定物質(zhì)會被分解或氧化[4]，從而使黃酮的提取率下降。因此，提取紫云英總黃酮的最佳超聲溫度為70℃。

2.1.2 液料比 在乙醇濃度60%、提取溫度70℃、提取時間120 min的條件下，不同液料比處理(10、20、30、40、50)對紫云英總黃酮提取率的影響如圖1B所示。在40的液料比時，總黃酮提取率最高；當(dāng)液料比大于40時，總黃酮提取率開始下降。究其原因可能是在液料比小于40時，紫云英與乙醇溶劑的接觸不夠充分，影響到黃酮類物質(zhì)的溶出量。增大液料比可增大紫云英顆粒內(nèi)外濃度差，減小黃酮從顆粒內(nèi)部溶到乙醇溶劑中的阻力，提取率增大；但當(dāng)液料比大于40時，過多的乙醇溶劑會增加濃縮帶來的損耗，使得黃酮提取率下降。因此，綜合考慮提取效率和減少溶劑用量，提取紫云英總黃酮的最佳液料比為40。

2.1.3 乙醇濃度 在液料比40、提取溫度70℃、提取時間120 min的條件下，不同乙醇濃度處理(10%、20%、25%、30%、35%)對紫云英總黃酮提取率的影響如圖1C所示。在乙醇濃度30%時，紫云英總黃酮的提取率最高；繼續(xù)增加乙醇濃度，總黃酮提取率開始下降。究其原因可能是乙醇濃度小于30%，乙醇溶劑的極性隨濃度的增大而減小，促進(jìn)紫云英黃酮類物質(zhì)溶解到乙醇溶劑中，總黃酮提取率增大；當(dāng)乙醇濃度大于30%時，溶劑極性降低，黃酮溶出量減少，并且易造成親酯性雜質(zhì)(葉綠素等)溶出[5]，造成與黃酮類物質(zhì)溶出競爭，使得提取率降低。因此，綜合考慮提取率和成本，提取紫云英總黃酮的最佳乙醇濃度為30%。

2.1.4 提取時間 在液料比40、乙醇濃度30%、提取溫度70℃的條件下，不同提取時間處理(60 min、80 min、100 min、120 min、140 min)對紫云英總黃酮提取率的影響如圖1D所示。提取時間100 min，紫云英總黃酮的提取率最高；繼續(xù)增加提取時間，總黃酮提取率開始下降。這與前人的研究結(jié)果類似，提取時間小于100 min，紫云英顆粒與乙醇溶劑接觸時間較短，總黃酮溶出不完全，提取率降低；當(dāng)提取時間大于100 min，熱效應(yīng)作用會破壞某些黃酮類物質(zhì)，使得黃酮的提取率降低[6]。因此，綜合考慮提取率和時間成本，最佳提取時間為100 min。

處理提取溫度(℃)液料比乙醇濃度(%)提取時間(min)提取率(%)處理提取溫度(℃)液料比乙醇濃度(%)提取時間(min)提取率(%)1-1-1002994160110357321-100329117-10-1031753-110031991810-10352341100338019-10103272500-1-1338120101033846001-13574210-10-13270700-11340822010-13311800113525230-10134919-100-13211240101342210100-13163250000361511-10013042260000371412100135542700003685130-1-10324228000036991401-1033392900003712150-1103297

2.2 紫云英總黃酮提取的響應(yīng)面分析

2.2.1 模型的建立及顯著性分析 綜合單因素試驗結(jié)果，利用Design Expert 8.05b軟件，以紫云英總黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對提取溫度(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取時間(D)4個主要影響因素進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表3 紫云英總黃酮提取工藝回歸方差分析

注：*表示P<0.05，顯著；**表示P<0.01，極顯著。

試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05b軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到紫云英總黃酮提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y=3.69+0.12A+0.044B+0.053C+0.046D+0.14AB-0.029AC-0.059AD-0.027BC-0.019BD+0.045CD-0.28A2-0.13B2-0.2C2-0.090D2

(2)

式中，Y：預(yù)測值、A：提取溫度、B：液料比、C：乙醇濃度、D：提取時間。

方程中各項系數(shù)的絕對值的大小直接反映各因素對紫云英黃酮提取率的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映影響的方向[7]。由表3可知，該二次方程回歸模型擬合極顯著(P<0.0001)。回歸方程一次項A和二次項A2、C2極顯著(P<0.01)，一次項C、D和二次項B2、D2顯著(P<0.05)，交互項AB顯著(P<0.05)，其他交互項不顯著(P>0.05)。說明紫云英總黃酮提取率與各試驗因素之間不是簡單的線性關(guān)系。回歸方程的失擬檢驗不顯著(F=4.26，P0.05)，說明未知的因素對該試驗的干擾很小[8]?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9296，表明該方程與實際情況擬合很好，所得的回歸方程能較好預(yù)測紫云英總黃酮提取率隨各影響因素變化的規(guī)律。4個影響因素的主效應(yīng)順序為提取溫度>乙醇濃度> 提取時間>液料比。

2.2.2 紫云英總黃酮提取的響應(yīng)面分析 紫云英總黃酮提取的響應(yīng)面圖如圖2所示，各影響因素的相互作用及對總黃酮提取率的影響可以通過響應(yīng)面坡度反映。圖2 I的響應(yīng)面坡度最為平緩，說明響應(yīng)值隨提取溫度的變化大于液料比的變化，即對紫云英總黃酮提取率的影響提取溫度大于液料比。圖2 III的響應(yīng)面的坡度平緩度次之，說明響應(yīng)值隨提取溫度的變化大于提取時間的變化，即對紫云英總黃酮提取率的影響提取溫度大于提取時間。其他各因素之間相似分析可得出其主效應(yīng)順序為提取溫度>乙醇濃度>提取時間>液料比，與2.2.1中的分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗證 在試驗設(shè)定的各因素范圍內(nèi)，紫云英總黃酮最高提取率預(yù)測值為3.713%，最佳提取工藝條件：乙醇濃度30.86%、液料比41.15、提取溫度72.55℃、提取時間105.54 min。校正工藝條件：乙醇濃度31%、液料比41、提取溫度73℃、提取時間106 min。對優(yōu)化試驗結(jié)果驗證，優(yōu)化紫云英的黃酮提取率為3.698%，與預(yù)測值3.713%基本一致(n=3，相對誤差為0.4%)。說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證該回歸方程的正確性，表明響應(yīng)面法適用于對紫云英總黃酮的乙醇提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英總黃酮提取工藝，建立的回歸方程為Y=3.69+0.12A+0.044B+0.053C+0.046D+0.14AB-0.029AC-0.059AD-0.027BC-0.019BD+0.045CD-0.28A2-0.13B2-0.2C2-0.090D2。方差分析結(jié)果表明，擬合檢驗極顯著，提取溫度、乙醇濃度影響顯著，該模型能較好地預(yù)測紫云英黃酮提取率隨4個主要影響因素變化的規(guī)律。優(yōu)化得到的提取紫云英總黃酮的最佳工藝條件：乙醇濃度31%、液料比41、提取溫度73℃、提取時間106 min，此工藝條件下的紫云英黃酮提取率為3.698%，與理論預(yù)測值(3.713%)的相對誤差為0.4%。說明該回歸方程的擬合性很好。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化紫云英總黃酮提取工藝條件是可行的，該研究為開發(fā)利用紫云英資源提供了基礎(chǔ)理論與參考。

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(責(zé)任編輯：劉新永)

Optimization of extraction process of total flavonoids fromAstragalussinicusby response surface method

ZHONG Shao-jie, HE Chun-mei, LIN Cheng

(InstituteofSoilandFertilizerofFAAS,FujianProvince350013)

In order to determine the optimum process conditions of ethanol extraction of total flavonoids fromAstragalussinicus, the response surface method was adopted to optimize the main process parameters by using the extraction rate of total flavonoids as index. The results showed that the optimum condition of extracting total flavonoids fromAstragalussinicuswere 31% ethanol concentration, 41 solid-liquid ratio, 73℃ extraction temperature, 106 min extraction time, and the extraction rate of total flavonoids was 3.698% with 0.4% relative error to predicted value.

Astragalussinicus; total flavonoids; extraction process

2016-09-05

鐘少杰，男，1985年生，研究實習(xí)員。

福建省公益類科研院所專項(2014R1022-9)；福建省種業(yè)項目(FJZ22Y-1530)；福建省科技計劃項目(2015R1022-3)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.09.003