李瑞雪　張繼全，2　吳　飛，2　馮　怡，2.上海中醫(yī)藥大學中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海20203；2.上海張江中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)工程研究中心，上海20203

香加皮有效成分提取工藝和檢測方法的研究進展

李瑞雪1張繼全1，2吳飛1，2馮怡1，2
1.上海中醫(yī)藥大學中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海201203；2.上海張江中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)工程研究中心，上海201203

香加皮是用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)中藥材。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，其相關(guān)藥理作用的起效成分逐步明確，相應(yīng)的制備工藝和檢測手段也逐漸完善。本文簡述了香加皮中五大類有效成分的提取工藝和檢測方法：C21甾體苷類一般采取乙醇溶液提取，使用大孔樹脂柱純化或者制備液相進行分離制備，多以HPLC-UV法（高效液相色譜法）進行分離檢測；強心苷類用甲醇或乙醇超聲提取，采用紫外分光光度法和HPLC法檢測；醛類采用硅膠、十八烷基硫酸鈉鍵合相（ODS）柱色譜等方法處理，HPLC法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS法）分析；脂肪酸類和其他類的提取和檢測方法也有涉及，為香加皮中相關(guān)成分的新藥研發(fā)提供參考。

香加皮；有效成分；提取工藝；檢測方法；C21甾體苷；強心苷

香加皮Cortex Periplocae為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium Bunge的根皮，又被稱為北五加皮、杠柳皮或者香五加皮。最早記載在古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，《中國藥典》自1977年也均有收載，功能主治為祛風濕、強筋骨，用于心悸氣短、下肢浮腫、風寒濕痹、腰膝酸軟。

香加皮中藥效活性成分主要分為C21甾體苷、強心苷、醛類化合物和有機酸類、三萜類、寡糖等化合物［2-5］，其中C21甾體苷和強心苷的藥理活性被作為主要研究對象［6］，在2015年版《中國藥典》中醛類化合物4-甲氧基水楊醛為中藥材的含量控制指標［7］。由于不同類型化合物的極性相差較大，根據(jù)目標成分不同選擇的提取工藝差異也較大，檢測方法也有所不同。本文對近年來香加皮的提取工藝和檢測方法研究進展進行綜述。

1　提取工藝

1.1C21甾體苷

迄今為止，在香加皮中33種C21甾類成分被發(fā)現(xiàn)，且均為孕甾烯醇類化合物［8］，具有一系列藥理活性，中國科學院藥物研究所左建平和趙維民課題組對C21甾體苷的藥理活性進行了深入研究［9-14］。在2008年發(fā)現(xiàn)了具有阻止風濕性關(guān)節(jié)炎病變進展的代表性化合物杠柳苷C（periploside C，PSC）［15］。

目前對C21甾體苷的提取、純化工藝研究不多，藥理活性研究的成分主要來自于實驗室規(guī)模的提取和實驗室級別的分離制備［9-16］。由于C21甾體苷極性較小，一般采取高濃度的乙醇溶液提取，然后使用大孔樹脂柱純化或者制備液相分離制備［17］。

將香加皮用95%乙醇提取，提取液濃縮至干，水溶解后氯仿萃取，氯仿層經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮梯度洗脫，得到的PSC純度達98%以上［18-19］。

將香加皮以70%乙醇加熱回流提取，濃縮至無醇，經(jīng)AB-8型大孔樹脂梯度洗脫后，將95%乙醇洗脫液按制備HPLC條件進行分離，發(fā)現(xiàn)一新的C21甾體化合物杠柳苷P［20］。

1.2強心苷

目前已發(fā)現(xiàn)2個強心苷元、2個強心苷，共計4個強心苷類化合物，均為甲型強心苷，其中杠柳毒苷的藥效活性被廣泛研究。杠柳毒苷又名杠柳苷G（periploside G），主要臨床藥效為質(zhì)量慢性充血性心力衰竭和心臟性浮腫［21］。

以杠柳毒苷作為指標成分，用不同濃度的乙醇進行提取時，楊虹［22］認為酒劑提取率最高，劉虹［23］認為60%乙醇提取率最高，徐廣忠［24］則采用90%乙醇進行提取，李丹毅［25］在考察提取溶劑時，確定以70%乙醇作為最優(yōu)提取溶劑。劉虹等［23］采用L9（34）正交實驗甄選香加皮最優(yōu)提取工藝，得到最佳工藝為：原料藥投放6倍量的60%乙醇，提取2 h，提取3次。李丹毅等［25］考察最優(yōu)提取溶劑和提取方法時，最終確定最佳提取條件為：原料中加入20倍體積的70%甲醇，超聲提取2次，每次30min。

徐廣忠等［24］取香加皮藥材粗粉，90%乙醇超聲3次，提取液濃縮成浸膏，石油醚萃取3次后繼續(xù)濃縮。將濃縮液稀釋至一定程度后過大孔樹脂柱，依次用純水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇沖洗，洗脫液濃縮后檢測，其中70%乙醇部位中杠柳毒苷含量達到97%以上。

劉虹等［26］分別取杠柳的根皮、莖皮、葉子、果實、根木質(zhì)部等部位，用以考察杠柳植株不同部位的杠柳毒苷含量的差異性。經(jīng)60℃干燥4 h，60目過篩，加50%乙醇超聲40 min后定容，結(jié)果顯示，杠柳根皮中的杠柳毒苷含量遠遠高于其他部分。

1.3醛類和有機酸類

4-甲氧基水楊醛，為香加皮中主要的醛類成分，亦是產(chǎn)生香氣的主要成分。但受產(chǎn)地和采收時期不同的影響，其含量亦有所不同［27］。2015年版《中國藥典》［7］中，采用4-甲氧基水楊醛含量作為控制香加皮藥材的質(zhì)量標準。

采用試管預(yù)試和圓形濾紙色譜預(yù)試法，初步得出香加皮根皮中含脂肪酸類化學成分的結(jié)論［28］。

鮑志燁等［26］考察香加皮用蒸餾水、水、60%乙醇3種不同提取溶劑對香加皮“質(zhì)量-毒性”的影響實驗中，以4-甲氧基水楊醛為指標成分，香加皮藥材用蒸餾水配制得全方水提取組分，加水或60%乙醇采用加熱回流提取方法分別制得水提組分和醇提組分。經(jīng)HPLC法測定3種提取方式中4-甲氧基水楊醛的含量由高到低分別為香加皮全方水提取組分、醇提組分、水提組分。

許俊潔等［27］優(yōu)化頂空固相微萃取法用于香加皮等藥材中揮發(fā)性成分的測定。通過考察萃取頭、取樣量、平衡時間、萃取溫度、萃取時間和解吸附時間等一系列因素，獲得頂空固相微萃取的最佳條件，后續(xù)結(jié)合GC-MS法分析香加皮中揮發(fā)性成分，結(jié)果表明，香加皮中揮發(fā)性成分為醛類、烴類和酯類，醛類中多為4-甲氧基水楊醛。

李金楠等［29］對香加皮中醛類和有機酸進行分離純化。實驗中，95%乙醇提取香加皮藥材，濃縮后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取部位經(jīng)硅膠柱分別進行梯度洗脫，所得化合物結(jié)構(gòu)鑒定顯示其主要成分包括異香草醛、4-甲氧基水楊酸、4-甲氧基水楊醛等。

1.4其他成分

段漓童等［30］對香加皮中多糖進行了分離純化，其分別依次使用石油醚、乙醚、80%乙醇回流提取去除雜質(zhì)，然后以水提醇沉法制備得到多糖。測定結(jié)果顯示香加皮中多糖含量約為5%，其中D-甘露糖、乳糖和葡萄糖是多糖的重要組成單元。

2　檢測方法

2.1C21甾體化合物

目前對于C21甾體化合物的制備純化和結(jié)構(gòu)鑒定研究雖然較活躍，但是檢測方法的報道較少。趙祎武等［33］就香加皮中7種孕甾烷糖苷類成分含量的HPLC檢測方法進行研究，采用菲羅門C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，在264 nm檢測波長下，測定7種成分的含量。結(jié)果顯示，進樣量與峰面積有著良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性和加樣回收率良好，12 h內(nèi)具有穩(wěn)定性，結(jié)果表明，該方法可作為香加皮藥材質(zhì)量控制的方法，且可為香加皮制劑的相關(guān)質(zhì)量控制提供方法學參考。

劉穎等［20］將香加皮提取的化合物通過正離子高分辨質(zhì)譜、香草醛-濃硫酸反應(yīng)，采用NMR及TOFMS技術(shù)鑒定為C21甾體化合物，并命名為杠柳苷P。

2.2強心苷類

賈素云等［34］采用香加皮的70%乙醇提取液，在278 nm波長處紫外檢測提取液中杠柳毒苷的含量，提取液質(zhì)量濃度在0.5×10-2～4.0×10-2mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

劉虹等［35］以抗心衰為應(yīng)用目的，以杠柳毒苷和杠柳苷元為指標成分，在實驗中采用高效液相色譜法，乙腈-0.5%磷酸（26∶74）為流動相，檢測波長為220 nm，定量測定香加皮提取物中兩種物質(zhì)的含量。

任曉亮等［36］同時測定杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛，并對流動相配比進行了改進。之前文獻報道［37］的流動相為乙腈∶水（27∶73），流速1.0mL/min，檢測波長220 nm，在此基礎(chǔ)上，加入了一定量的甲醇，使得分析周期縮短并改善了色譜法的拖尾現(xiàn)象。

2.3醛類和有機酸類

李天祥等［38］以不同收采期、不同產(chǎn)地的香加皮中4-甲氧基水楊醛的含量為研究對象，將提取液經(jīng)HPLC法測定，結(jié)果表明，不同收采期不同產(chǎn)地香加皮中4-甲氧基水楊醛的含量存在較大差異。

黃榮華等［39］改進了用HPLC測定4-甲氧基水楊醛的含量時，加入內(nèi)標物質(zhì)對羥基甲酸丁酯的方法，采用C18柱，高效液相色譜法，流動相為甲醇-水-醋酸（70∶30∶2），檢測波長為278 nm。該方法具有簡便、準確、重復(fù)性好等優(yōu)點。

許俊潔等［30］用GC-MS法分析香加皮中的揮發(fā)性成分時，共計分離出了19個化合物，經(jīng)鑒定占揮發(fā)性成分總量的93%，其中4-甲氧基水楊醛占88.7%。

佟玲等［40］測定香加皮甲醇提取液中異香草醛的含量，用反相高效液相色譜法結(jié)果顯示，提取液濃度在1.65～13.7μg/mL范圍內(nèi)，具良好線性關(guān)系。

李莉［41］采用GC-MS法分析香加皮中的脂肪酸成分，共鑒定出包括棕櫚酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、花生酸等在內(nèi)的21種脂肪酸，其中，不飽和脂肪酸占總量的51.87%，并且多不飽和脂肪酸占總量的36.91%。

2.4其他成分

段漓童等［32］對香加皮中多糖成分的測定使用了硫酸苯酚比色法：精密稱取干燥香加皮粉末，用80%乙醇和去離子水分別索氏提取，吸取提取液加苯酚和濃硫酸，測定吸光度，測得香加皮中多糖成分的含量為5.38%。

3　小結(jié)

中醫(yī)臨床上，香加皮和五加皮由于外形相似容易混淆、混用。但香加皮和五加皮無論在主要成分、藥理作用還是在臨床應(yīng)用方面都有所不同。因為二者價格偏差，長期以來，多數(shù)的摻偽發(fā)生在以香加皮冒充五加皮，但如果過度使用香加皮，可由于香加皮中的強心苷類毒性成分造成患者中毒［42-43］，為保證臨床用藥的安全以及合理使用，老年患者及有高血壓的患者應(yīng)慎用香加皮［43-46］，并且在使用含有五加皮的處方或者保健品時注意香加皮摻偽。

隨著對香加皮有效部位和有效成分研究的不斷深入，其所具有的強心［47-48］、抗癌［49-50］、抗炎、免疫調(diào)節(jié)［51］以及細胞分化誘導、殺蟲、鎮(zhèn)痛等生理作用相繼被發(fā)現(xiàn)，并有待繼續(xù)深入探究。目前，藥效成分主要來自于香加皮的中藥新藥有已經(jīng)上市的有芪藶強心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z20040141），中科院藥物研究所正在開發(fā)的用于抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎病變惡化的杠柳苷類中藥五類新藥，同時中科院藥物研究所和上海有機所合作打通了PSC的實驗室全合成路徑［52］，香加皮的臨床價值和新藥開發(fā)前景光明，將掀起一輪研究和開發(fā)的熱點［53-55］。

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Advances in research on extraction process and analytical method of effective ingredients in Cortex Perip locae

LIRuixue1ZHANG Jiquan1，2WU Fei1，2FENG Yi1，2
1.Ministry of Education，Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Engineering Research Center，Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine of Zhangjiang Shanghai，Shanghai 201203，China

Cortex Periplocae is one kind of traditional Chinese medicines for the treatment of rheumatoid arthritis. With the continuous research，the related pharmacological ingredients have been discovered gradually while the corresponding extraction process and analytical method have been widely studied.The extraction process and analytical method of 5 kinds of ingredients in cortex periplocae were summrized in this paper.C21steroidal glycosideswere generally extracted by ethanol，purified bymacroporous resin or separated by preparative HPLCmethod，detected by ultraviolet-visible detect.Cardiac glycosides were ultrasonic extracted with methanol or ethanol.Cardiac glycosides were quantitatively analyzed by ultraviolet-visible spectrometry or HPLCmethod.Aldehydes were purified by silica gel and ODS column chromatography，and analyzed by HPLC or GC-MS.This paper also summrized fatty acids and other ingredients.The advances in research on the extraction process and analyticalmethod have been reviewed in this paper，in order to provide references for development of the related new drugs.

Cortex Periplocae；Effeective ingredients；Extration process；Analytical method；C21steroidal glycosides；Cardiac glycosides

R927.11

A

1673-7210（2016）06（c）-0037-05

上海市衛(wèi)計委項目資助項目（ZY3-CCCX-3-5001）；上海市科委平臺資助項目（15DZ2292000）。

李瑞雪（1991.8-），女，上海中醫(yī)藥大學2014級中藥學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中藥新藥研究。

張繼全（1977.6-），男，碩士，高級工程師；研究方向：中藥新產(chǎn)品開發(fā)、中藥工程化研究。吳飛（1983.8-），男，上海中醫(yī)藥大學2015級中藥學專業(yè)在讀博士研究生；研究方向：中藥制劑分析和藥物分析。

（2016-02-27本文編輯：趙魯楓）