劉 瑩 廖芝玲 向邦德

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1 病理科，2 肝膽外科，南寧市 530021，E-mail：54570377@qq.com)

論著·基礎(chǔ)研究

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3及熱休克蛋白70在肝細胞結(jié)節(jié)性病變中的表達及意義▲

劉 瑩1廖芝玲1向邦德2

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1 病理科，2 肝膽外科，南寧市 530021，E-mail：54570377@qq.com)

目的 探討磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、熱休克蛋白70(HSP70)在局灶性結(jié)節(jié)性增生、肝細胞腺瘤、異型增生結(jié)節(jié)和高分化肝細胞癌組織中的表達及意義。方法 用免疫組化檢測局灶性結(jié)節(jié)性增生21例、肝細胞腺瘤10例、低級別異型增生結(jié)節(jié)13例、高級別異型增生結(jié)節(jié)34例及高分化肝細胞癌32例患者病灶組織中GPC3、HSP70的表達。結(jié)果 GPC3在局灶性結(jié)節(jié)性增生、肝細胞腺瘤、低級別異型增生結(jié)節(jié)、高級別異型增生結(jié)節(jié)、高分化肝細胞癌組織中的陽性率分別為0、0、7.69%(1/13)、14.71%(5/34)、59.38%(19/32)。HSP70在局灶性結(jié)節(jié)性增生、肝細胞腺瘤、低級別異型增生結(jié)節(jié)、高級別異型增生結(jié)節(jié)、高分化肝細胞癌組織中的陽性率分別為9.52%(2/21)、0、0、20.59%(7/34)、62.5%(20/32)。高分化肝細胞癌組織的GPC3、HSP70陽性率均高于其他組織(P<0.05)，局灶性結(jié)節(jié)性增生、肝細胞腺瘤、低級別異型增生結(jié)節(jié)、高級別異型增生結(jié)節(jié)間GPC3、HSP70陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 GPC3、HSP70對鑒別良惡性肝細胞結(jié)節(jié)性病變有重要意義，但對非癌性結(jié)節(jié)性病變間的鑒別無意義。

肝癌；肝細胞結(jié)節(jié)性病變；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；熱休克蛋白70；良性病變；惡性病變；鑒別診斷

原發(fā)性肝細胞癌在我國惡性腫瘤中的發(fā)病率及死亡率分別為第4位和第2位[1]。廣西是肝癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率高于全國水平[2]。多數(shù)原發(fā)性肝細胞癌患者就診時病情已處于中晚期，錯過了治療的最佳時機。有研究表明亞洲肝癌患者總體5年生存率為42%，而早期肝癌患者的5年生存率為67%[3]。因此，及早發(fā)現(xiàn)肝癌，甚至于癌前病變期發(fā)現(xiàn)，對于將疾病止于癌前病變期、盡早獲得治療、提高治療效果、降低死亡率、改善生命質(zhì)量均有積極意義。

隨著體檢的普及，越來越多的肝細胞結(jié)節(jié)性病變在影像學檢查中即被發(fā)現(xiàn)。常見的肝細胞結(jié)節(jié)性病變包括局灶性結(jié)節(jié)性增生、肝細胞腺瘤、異型增生結(jié)節(jié)和肝細胞癌。但對于體積較小的病變，影像學常難以明確診斷。而肝細胞結(jié)節(jié)性病變的正確診斷至關(guān)重要，其對于治療方案的選擇、預(yù)后的判斷起到重要作用。而對于病理學診斷，有時僅憑形態(tài)學亦難以區(qū)分，需要免疫組織化學協(xié)助診斷。本研究應(yīng)用免疫組織化學方法檢測磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)在肝細胞結(jié)節(jié)性病變中的表達水平，評估其在肝細胞病變診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年7月至2015年6月在我院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的肝細胞結(jié)節(jié)性病變患者110例，其中男性79例、女性31例，年齡14～77歲，中位年齡50歲，所有患者均行手術(shù)治療，手術(shù)前均未行放化療。其中局灶性結(jié)節(jié)性增生21例、肝細胞腺瘤10例、低級別異型增生結(jié)節(jié)13例、高級別異型增生結(jié)節(jié)34例及高分化肝細胞癌32例；其中低級別異型增生結(jié)節(jié)11例和高級別異型增生結(jié)節(jié)24例為肝癌癌旁組織。5組的性別及年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 5組的性別及年齡比較

1.2 主要試劑 鼠抗人GPC3單克隆抗體，克隆號：1G12，購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，即用型，規(guī)格：3ml/支，生產(chǎn)批號：15701B09。鼠抗人HSP70單克隆抗體，克隆號：W27，購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，即用型，規(guī)格：3 ml/支，生產(chǎn)批號：15T41512。

1.3 GPC3、HSP70檢測方法 GPC3、HSP70均采用SupervisionTM二步法進行檢測。手術(shù)所取病變組織經(jīng)10%甲醛固定6～48 h后，常規(guī)制成蠟塊，3 μm連續(xù)切片，65℃烤片1 h，脫蠟，pH 8.0乙二胺四乙酸高壓修復，3%過氧化氫阻斷，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液洗片后加酶標鼠兔通用型二抗室溫孵育18 min，再經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗片，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精襯染。

1.4 結(jié)果判斷 GPC3陽性表達有3種模式，分別為胞膜陽性、胞漿陽性以及胞膜和胞漿均陽性。HSP70陽性表達定位于胞漿和胞核。二者均采用著色強度得分與陽性細胞率得分相加法進行染色評分。著色強度評分：無色評為0分，淡黃色評為1分，棕黃色評為2分，棕褐色評為3分。陽性細胞率評分：<10%細胞陽性評為0分，10%～25%細胞陽性評為1分，>25%～50%細胞陽性評為2分，>50%～75%細胞陽性評為3分，>75%細胞陽性評為4分。兩項總分≤3分為陰性，>3分為陽性[4]。

1.5 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，比較采用方差分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組組織標本鏡下所見情況

2.2.1 局灶性結(jié)節(jié)性增生：多數(shù)病例大體可見特征性的中央星狀瘢痕，鏡下見放射狀增生的纖維組織將肝細胞分割成多個結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)間纖維間隔中的厚壁小動脈伴淋巴細胞浸潤具有特征性，缺乏肝小葉結(jié)構(gòu)和匯管區(qū)，肝細胞無明顯異型性。見圖1。

圖1 局灶性結(jié)節(jié)性增生鏡下表現(xiàn)A：中央星狀瘢痕，缺乏肝小葉結(jié)構(gòu)和匯管區(qū)(蘇木精-伊紅染色，×50)；B：肝細胞無明顯異型性(蘇木精-伊紅染色，×200)

2.1.2 肝細胞腺瘤：鏡下可見2～3層肝細胞排列成梁索狀或腺管狀，肝竇受壓。部分肝細胞腺瘤有輕度非典型增生?？捎兄咀冃?，炎細胞浸潤，膽管反應(yīng)，肝竇擴張，少數(shù)可見腺泡、腺管樣排列，其中可見膽汁。見圖2。

圖2 肝細胞腺瘤鏡下表現(xiàn)

A：病灶有完整包膜，無浸潤，可見假腺管結(jié)構(gòu)(蘇木精-伊紅染色，×50)；B：2～3層肝細胞排列成梁索狀，肝竇受壓，細胞分化好，異型性不明顯(蘇木精-伊紅染色，×200)

2.1.3 異型增生結(jié)節(jié)：(1)低級別異型增生結(jié)節(jié)鏡下表現(xiàn)為細胞密度輕度增加，有大細胞變，無明顯結(jié)構(gòu)異常，見圖3A、圖3B。(2)高級別異型增生結(jié)節(jié)鏡下可見肝細胞兼具有細胞和組織學異型性，可有大細胞變、小細胞變、脂肪變、透明細胞變等，其中小細胞變是診斷的要點。細胞密度增高，肝板增厚，厚度為2～3層，小梁狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可形成腺樣結(jié)構(gòu)，少數(shù)病例可出現(xiàn)非配對動脈及局灶性肝竇血管化。見圖3C、圖3D。

圖3 異型增生結(jié)節(jié)鏡下表現(xiàn)

A：低級別異型增生結(jié)節(jié)低倍鏡下見細胞密度增加，無明顯結(jié)構(gòu)異常(蘇木精-伊紅染色，×50)；B：低級別異型增生結(jié)節(jié)高倍鏡下見大細胞變(蘇木精-伊紅染色，×200)；C：高級別異型增生結(jié)節(jié)低倍鏡下細胞密度顯著增加，小梁狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，匯管區(qū)減少(蘇木精-伊紅染色，×50)；D：高級別異型增生結(jié)節(jié)高倍鏡下見小細胞變，肝板增厚(蘇木精-伊紅染色，×200)

2.1.4 高分化肝細胞癌：鏡下觀癌細胞排列成梁索狀，梁索間血竇清晰，肝板增厚，大于3層，癌細胞輕度異型，胞核較大，核漿比增高，核仁明顯，偶可見核分裂象。見圖4。

圖4 高分化肝細胞癌鏡下表現(xiàn)

A：大于3層肝細胞排列成梁索狀(蘇木精-伊紅染色，×50)；B：細胞異型性較異型增生結(jié)節(jié)更為顯著(蘇木精-伊紅染色，×200)

2.2 各組標本GPC3及HSP70的表達 GPC3在局灶性結(jié)節(jié)性增生、肝細胞腺瘤組織中不表達，在低級別異型增生結(jié)節(jié)及高級別異型增生結(jié)節(jié)組織中低表達，在肝細胞癌組織中高表達，見圖5。HSP70在肝細胞腺瘤及低級別異型增生結(jié)節(jié)組織中不表達，在局灶性結(jié)節(jié)性增生及高級別異型增生結(jié)節(jié)組織中呈低表達，在肝細胞癌中表達顯著高于非癌性病變，見圖6。4組非癌性結(jié)節(jié)性病變組織GPC3及HSP70的表達陽性率均低于高分化肝細胞癌組織比較(P<0.05)，而4組非癌性結(jié)節(jié)性病變組織間GPC3、HSP70的表達陽性率兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組標本組織中GPC3及HSP70的表達(n，%)

注：與高分化肝細胞癌比較，*P<0.05。

圖5 各組標本GPC3的表達情況(免疫組織化學染色，×200)

A：局灶性結(jié)節(jié)性增生組織GPC3陰性表達；B：肝細胞腺瘤組織GPC3陰性表達；C：低級別異型增生結(jié)節(jié)組織GPC3陰性表達；D：高級別異型增生結(jié)節(jié)組織GPC3陰性表達；E：高級別異型增生結(jié)節(jié)組織GPC3陽性表達；F：高分化肝細胞癌組織GPC3陽性表達。

圖6 各組標本HSP70的表達情況(免疫組織化學染色，×200)

A：局灶性結(jié)節(jié)性增生組織HSP70陰性表達；B：肝細胞腺瘤組織HSP70陰性表達；C：低級別異型增生結(jié)節(jié)組織HSP70陰性表達；D：高級別異型增生結(jié)節(jié)組織HSP70陰性表達；E：高級別異型增生結(jié)節(jié)組織HSP70陽性表達；F：高分化肝細胞癌組織HSP70陽性表達。

3 討 論

典型的肝細胞結(jié)節(jié)性病變僅憑形態(tài)學即可做出病理診斷，而在實際工作中，并非所有病例都十分典型，尤其是在肝硬化背景下，鑒別診斷變得十分困難，而對細針穿刺獲取的組織進行鑒別則更具挑戰(zhàn)。此時需要借助于免疫組織化學協(xié)助以明確診斷。GPC3是膜性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一員，在人類胚胎及胎兒期高表達，成人后僅在胎盤中高表達，少數(shù)組織低表達，在肝癌中高表達，而在正常肝組織、肝的非癌性病變中不表達或低表達[5]。HSP70是一種熱休克蛋白，與腫瘤細胞的增殖相關(guān)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中HSP70的表達逐漸增高[6]，在肝細胞癌的表達明顯高于肝臟的非癌性病變，因此有助于良惡性肝細胞結(jié)節(jié)性病變的鑒別。

局灶性結(jié)節(jié)性增生是肝的再生性病變，屬良性病變，罕見惡變?yōu)楦渭毎┑膱蟮馈Ｖ醒胄菭铖：凼瞧涮卣餍愿淖?，鏡下見放射狀增生的纖維組織將肝細胞分割成多個結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)間纖維間隔中見厚壁小動脈伴淋巴細胞浸潤，缺乏肝小葉結(jié)構(gòu)和匯管區(qū)，肝細胞無明顯異型性。有研究顯示局灶性結(jié)節(jié)性增生組織的GPC3表達皆為陰性[7-8]，而本研究中21例局灶性結(jié)節(jié)性增生組織中GPC3亦均為陰性表達，與上述文獻結(jié)果一致。有2例局灶性表達HSP70，但表達陽性率低于肝細胞癌組織(P<0.05)，與彭紹華等[9]的研究結(jié)果相符。

肝細胞腺瘤是肝上皮來源的良性腫瘤，但仍有極少數(shù)可惡變?yōu)楦渭毎?，國外研究結(jié)果顯示該病多見于育齡婦女，其發(fā)生與長期口服避孕藥或類固醇及某些代謝性疾病有關(guān)[10]。肝細胞腺瘤根據(jù)基因型或表型的不同，可分為4個分子亞型，其共同的形態(tài)學特征為鏡下觀可見2～3層肝細胞排列成梁索狀或腺管狀，無匯管和膽管結(jié)構(gòu)。部分肝細胞腺瘤有輕度非典型增生，與肝細胞癌的鑒別有一定困難。本研究中，有1例肝細胞腺瘤大小為6 cm×4.2 cm×4 cm，有較多假腺管結(jié)構(gòu)，內(nèi)含膽栓，伴非典型增生，與高分化肝細胞癌難鑒別；后經(jīng)上海東方肝膽外科醫(yī)院會診，認為該病例細胞分化較好，異型性不明顯，有完整纖維包膜，無明顯侵犯現(xiàn)象，免疫組化HSP70(-)，GPC3(-)，考慮為肝細胞腺瘤；但該病例的假腺管增多，提示增殖活躍，因此應(yīng)注意有無癌變風險。多項研究表明肝細胞腺瘤不表達GPC3及HSP70[7-8，11]，與本研究結(jié)果一致。

異型增生結(jié)節(jié)是發(fā)生在肝大面積損傷(如肝硬化、肝炎)基礎(chǔ)上發(fā)生的再生結(jié)節(jié)，可分為低級別異型增生結(jié)節(jié)和高級別異型增生結(jié)節(jié)。低級別異型增生結(jié)節(jié)細胞密度輕度增加，有大細胞變，無明顯結(jié)構(gòu)異常。低級別異型增生結(jié)節(jié)預(yù)后良好，僅需隨訪，而無需立即處理[12]。高級別異型增生結(jié)節(jié)肝細胞兼具有細胞和組織學異型性，但不足以診斷為肝細胞癌，可有大細胞變、小細胞變、脂肪變、透明細胞變等，細胞密度增高，肝板增厚，厚度大于2層，小梁狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可形成腺樣結(jié)構(gòu)。高級別異型增生結(jié)節(jié)與肝細胞癌關(guān)系密切，屬交界性病變，對兩者的鑒別診斷曾存在分歧，而在2008年多國專家共同組成肝細胞腫瘤國際共識小組，才確定間質(zhì)浸潤為鑒別診斷的關(guān)鍵點[13]。Coston等[8]的研究則顯示GPC3在低級別異型增生結(jié)節(jié)表達的敏感度為7.0%，而高級別異型增生結(jié)節(jié)為23.0%，而本研究中，在13例低級別異型增生結(jié)節(jié)中僅1例出現(xiàn)局灶性表達GPC3(7.69%)，在高級別異型增生結(jié)節(jié)中陽性率為14.71%。Di Tommaso等[14]的研究發(fā)現(xiàn)HSP70在高級別不典型增生結(jié)節(jié)的陽性率為5%，低級別不典型增生結(jié)節(jié)沒有陽性表達，而在本研究中兩者HSP70的陽性率則分別為20.59%和0%。本組高級別異型增生結(jié)節(jié)組織的GPC3及HSP70陽性率高于以上文獻的結(jié)果，但仍低于在肝細胞癌中的陽性率(P<0.05)。

此外，本研究結(jié)果顯示，4組非癌性結(jié)節(jié)性病變組織間GPC3、HSP70的表達陽性率兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示GPC3、HSP70對非癌性結(jié)節(jié)性病變間的鑒別可能無意義。

綜上所述，GPC3、HSP70在肝細胞結(jié)節(jié)性病變良惡性的鑒別中的應(yīng)用具有重要意義，但對于具體病例良惡性的鑒別，即使GPC3、HSP70均為陰性仍不能排除肝細胞癌的可能，需結(jié)合形態(tài)學以明確診斷，多個指標的聯(lián)合應(yīng)用有助于進一步提高診斷的準確性[15]。

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Expression and significance of glypican-3 and heat shock protein 70 in hepatocellular nodular lesions

LIUYing1,LIAOZhi-ling1,XIANGBang-de2

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the expression and significance of glypican-3(GPC3) and heat shock protein 70(HSP70) in focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,dysplastic nodule and well-differentiated hepatocellular carcinoma tissues.Methods The expressions of GPC3 and HSP70 were detected in the tissues of focal nodular hyperplasia(n=21),hepatocellular adenoma(n=10),low-grade dysplastic nodule(n=13),high-grade dysplastic nodule(n=34) and well-differentiated hepatocellular carcinoma(n=32).Results The positive expression rates of GPC3 in focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,low-grade dysplastic nodule,high-grade dysplastic nodule and well-differentiated hepatocellular carcinoma tissues were 0,0,7.69%(1/13),14.71%(5/34) and 59.38%(19/32) respectively.The positive expression rates of HSP70 in focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,low-grade dysplastic nodule,high-grade dysplastic nodule and well-differentiated hepatocellular carcinoma tissues were 9.52%(2/21),0,0,20.59%(7/34) and 62.5%(20/32) respectively.The positive expression rates of GPC3 and HSP70 in the well-differentiated hepatocellular carcinoma tissue were higher than the rates in the other tissues(P<0.05).There was no statistical difference in the positive expression rate of GPC3 or HSP70 among focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,low-grade dysplastic nodule,high-grade dysplastic nodule tissues(P>0.05).Conclusion GPC3 and HSP70 have an important significance in differentiating benign hepatocellular nodular lesions from malignant hepatocellular lesions,but have no significance in differentiating among benign hepatocellular nodular lesions.

Hepatocellular adenoma,Hepatocellular nodular lesion,Glypican-3,Heat shock protein 70,Benign leision,Malignant leision,Differential diagnosis

國家自然科學基金(81260331/H1607)

劉瑩(1985～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤的診斷。

廖芝玲(1963～)，女，博士，教授，研究方向：消化道腫瘤的診斷，E-mail：54570377@qq.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)03-0297-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.01

2016-01-04

2016-03-11)