胡瑞婷 歐世寧 覃東華 秦 超

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，南寧市 530001，E-mail：214846642@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧市 530021)

論著·基礎(chǔ)研究

缺血性腦卒中患者外周血miRNA生物信息學(xué)分析研究▲

胡瑞婷1歐世寧1覃東華1秦 超2

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，南寧市 530001，E-mail：214846642@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧市 530021)

目的 應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析缺血性腦卒中患者外周血中微小RNA(miRNA)的靶基因及其功能、在疾病中的作用。方法 在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索缺血性腦卒中基因芯片數(shù)據(jù)，并利用生物信息學(xué)工具篩選差異表達(dá)的miRNA，對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析，對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析及信號(hào)通路分析，最后構(gòu)建miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和miRNA靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果 檢索到芯片數(shù)據(jù)GSE55937，篩選得到50個(gè)差異表達(dá)的miRNA。篩選出的miRNA的靶基因的合集共7 557個(gè)。這些靶基因的功能主要為DNA依賴轉(zhuǎn)錄、DNA依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等，主要分布在絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路等信號(hào)通路。miRNA功能的調(diào)控分析及miRNA靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖提示，人類miRNA(hsa-miR)-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p中心度最高。結(jié)論 缺血性腦卒中患者外周血中存在差異性表達(dá)的miRNA，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)。

缺血性腦卒中；微小RNA；生物信息學(xué)

缺血性腦卒中為臨床常見的疾病，多種相關(guān)基因的表達(dá)在該病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由20～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因的mRNA配對(duì)形成沉默復(fù)合體，進(jìn)而誘發(fā)靶基因mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行負(fù)調(diào)控[2]。目前國(guó)外已有缺血性腦卒中全基因組芯片研究報(bào)告[3-4]，但這些研究?jī)H對(duì)芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析。為深入探討這些數(shù)據(jù)的價(jià)值，本文通過BioConductor和R統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)這些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行生物學(xué)功能、信號(hào)通路富集分析，最后進(jìn)行miRNA功能的調(diào)控分析和構(gòu)建miRNA靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示與缺血性腦卒中相關(guān)的miRNA的生物學(xué)功能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載卒中患者miRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集均須符合以下3個(gè)條件：(1)數(shù)據(jù)集來自全基因組miRNA表達(dá)芯片；(2)包含有卒中患者與正常對(duì)照；(3)數(shù)據(jù)包含完整的芯片數(shù)據(jù)或標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)miRNA的篩選 在R軟件(3.2.1版本)環(huán)境下，使用Bioconductor(3.1版本)中的limma軟件包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化和log2轉(zhuǎn)換。以P<0.05、倍性變化>1.2倍為閾值進(jìn)行差異表達(dá)miRNA的篩選。

1.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析 分別采用miRanda(www.microrna.org/)和TargetScan(www.targetscan.org/)網(wǎng)站對(duì)篩選出來的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析，再取兩個(gè)網(wǎng)站得到的共同靶基因進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 生物學(xué)功能分析和信號(hào)通路分析 對(duì)篩選出來的差異表達(dá)miRNA提交到DAIVD網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行生物學(xué)功能(GeneOntology，GO)分析。利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)網(wǎng)站(http://www.kegg.jp/)對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行信號(hào)通路分析。

1.5 miRNA功能的調(diào)控分析 采用GCBI網(wǎng)站(www.gcbi.com.cn/gclib)中的miRNA功能模塊進(jìn)行分析。通過miRNA與顯著性GO之間的間接關(guān)系，來構(gòu)造GO與miRNA的關(guān)系鄰接矩陣，從而形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，并通過定量化分離出具有核心調(diào)控作用的miRNA，并發(fā)現(xiàn)多種miRNA集中調(diào)控的核心基因功能。

1.6 miRNA靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 采用GCBI網(wǎng)站(www.gcbi.com.cn/gclib)中的miRNA靶基因模塊進(jìn)行分析。用miRNA與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系來建立miRNA-gene作用網(wǎng)絡(luò)。通過基因與miRNA的屬性關(guān)系建造基因與miRNA的鄰接矩陣，從而形成相互作用網(wǎng)絡(luò)。用節(jié)點(diǎn)的連通度來表示節(jié)點(diǎn)的重要程度，用來衡量miRNA對(duì)周圍的基因的貢獻(xiàn)程度，或基因?qū)χ車膍iRNA的貢獻(xiàn)程度。

2 結(jié) 果

2.1 GSE芯片數(shù)據(jù)特征 經(jīng)檢索GEO數(shù)據(jù)庫，得到GSE55937芯片數(shù)據(jù)集，該芯片用于檢測(cè)缺血性腦卒中患者與合并有腦血管風(fēng)險(xiǎn)患者外周血miRNA表達(dá)水平[5]。該研究共檢測(cè)了48個(gè)樣本，缺血性卒中患者和腦血管風(fēng)險(xiǎn)患者外周血樣本各24例，其采用Affymetrix Multispecies miRNA-3 Array平臺(tái)。

2.2 差異表達(dá)miRNA檢測(cè) 通過R軟件分析，經(jīng)過log2校正和質(zhì)量控制分析后，去除不合格樣本結(jié)果，該組芯片得到50個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)miRNA 41個(gè)，下調(diào)miRNA 9個(gè)，包括人類miRNA(homo sapiens-miRNA，hsa-miR)-409-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-371b-5p。前10個(gè)差異表達(dá)miRNA的情況見表1。

表1 前10個(gè)差異表達(dá)miRNA

2.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè) 對(duì)差異表達(dá)的miRNA經(jīng)miRanda和TargetScan軟件預(yù)測(cè)，取交集共得到7 557個(gè)靶基因。

2.4 miRNA靶基因功能分析和信號(hào)通路分析 對(duì)7 557個(gè)miRNA的靶基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因的功能主要集中在DNA依賴轉(zhuǎn)錄、DNA依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子正調(diào)節(jié)等功能上。在KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要分布在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路、腫瘤蛋白聚糖信號(hào)通路等。見表2。

表2 差異表達(dá)miRNA靶基因生物學(xué)功能和信號(hào)通路

注：PI3K-Akt為磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶(protein kinase B，Akt)。

2.5 miRNA功能性網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析 通過構(gòu)建差異表達(dá)miRNA與細(xì)胞生物學(xué)功能的網(wǎng)絡(luò)，分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等miRNA的中心度最高。見表3。

表3 miRNA功能性網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析

2.6 miRNA靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析 用mRNA與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系來建立miRNA-gene作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等對(duì)周圍的靶基因的中心度最高。見圖1。

圖1 miRNA靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

注：紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)；方形代表miRNA，圓形代表靶基因；連線代表miRNA與靶基因存在調(diào)控關(guān)系。

3 討 論

卒中是當(dāng)今威脅人類生命的主要疾患之一，其發(fā)生率和死亡率一直高居不下，而缺血性腦卒中是卒中最常見的類型。缺血性卒中的發(fā)病原因復(fù)雜，但大多數(shù)是由于動(dòng)脈粥樣硬化繼發(fā)動(dòng)脈閉塞或狹窄導(dǎo)致的。如何有效地保護(hù)腦神經(jīng)、促進(jìn)受損的神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)一直是研究的熱點(diǎn)，但迄今為止該問題仍未得到較好的解決，其中一個(gè)重要的原因就是是對(duì)該病發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未完全了解[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，單獨(dú)用某一基因或信號(hào)通路的結(jié)果難以完全解釋某疾病發(fā)生、發(fā)展過程。高通量的生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，即基因芯片檢測(cè)技術(shù)可以一次性獲取大量的基因表達(dá)信息，通過生物信息方法分析這些基因表達(dá)信息，可以了解活體細(xì)胞內(nèi)生物分子及其間的相互作用，從而找出疾病發(fā)生過程中的關(guān)鍵因子，為臨床治療設(shè)計(jì)靶點(diǎn)提供依據(jù)[7]。

miRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，而且絕大部分定位于基因間隔區(qū)。其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因，并不翻譯成蛋白質(zhì)，而是在體內(nèi)代謝過程中起到多種調(diào)控作用。miRNA精細(xì)調(diào)節(jié)基因的時(shí)序性表達(dá)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟和多種神經(jīng)生理過程中，miRNA起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[8]。最近的研究表明，急性缺血性腦卒中患者發(fā)病24 h內(nèi)外周血漿中即存在差異表達(dá)的miRNA，這些差異表達(dá)的miRNA可能與缺血性卒中早期的缺血缺氧應(yīng)激、血腦屏障破壞、早期再灌注損傷等有關(guān)，也有可能作為缺血性卒中早期干預(yù)新的治療方向和靶點(diǎn)[9]。有學(xué)者對(duì)16例缺血性卒中不同亞型患者的基因芯片分析后發(fā)現(xiàn)，大動(dòng)脈粥樣硬化性型卒中患者及小動(dòng)脈閉塞性型卒中患者血漿miRNAs表達(dá)譜存在明顯差異[10]。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中的缺血性腦卒中基因芯片原始數(shù)據(jù)，并使用軟件包分析差異表達(dá)的miRNA，根據(jù)設(shè)定的閾值得到上調(diào)miRNA 41個(gè)、下調(diào)miRNA 9個(gè)。通過進(jìn)一步的生物學(xué)功能和信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的miRNA主要集中在DNA依賴轉(zhuǎn)錄、DNA依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程中，主要通過MAPK信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路、腫瘤蛋白聚糖信號(hào)通路等發(fā)揮作用。miRNA發(fā)揮生物學(xué)作用主要是通過對(duì)其靶基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，通過分析這些差異表達(dá)miRNA的功能發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等miRNA的中心度最高。進(jìn)一步的miRNA靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析也表明，hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p等對(duì)周圍的靶基因的中心度最高，提示這些miRNA是調(diào)控的核心miRNA功能。

總之，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出缺血性腦卒中患者差異表達(dá)miRNA，分析了這些miRNA的生物學(xué)功能和調(diào)控通路，并從中找到了具有核心功能的miRNA，為后期實(shí)驗(yàn)研究提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)，也為確定缺血性腦卒中早期診斷標(biāo)志與新治療靶位開辟了新的思路。

[1] Silasi G MT,Murphy TH.Stroke and the connectome:how connectivity guides therapeutic intervention[J].Neuron,2014,83(6):1 354-1 368.

[2] Nilsen TW.Mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in animal cells[J].Trends Genet,2007,23 (5):243-249.

[3] Krug T,Gabriel JP,Taipa R,et al.TTC7B emerges as a novel risk factor for ischemic stroke through the convergence of several genome-wide approaches[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(6):1 061-1 072.

[4] Rosell A,Vilalta A,García-Berrocoso T,et al.Brain perihematoma genomic profile following spontaneous human intracerebral hemorrhage[J].PLoS One,2011,6(2):e16 750.

[5] Jickling GC,Ander BP,Zhan XH,et al.microRNA expression in peripheral blood cells following acute ischemic stroke and their predicted gene targets[J].PLoS One,2014,9(6):e99 283.

[6] Liu XS,Chopp M,Zhang RL,et al.MicroRNAs in cerebral ischemia-induced neurogenesis[J].J Neuropathol Exp Neurol,2013,72(8):717-721.

[7] 滕牧洲,馬文麗.走近醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的基因芯片技術(shù)[J].分子診斷與治療雜志,2014,6(6):361-365.

[8] Tan JR,Koo YX,Kaur P,et al.microRNAs in stroke pathogenesis[J].Curr Mol Med,2011,11(2):76-92.

[9] 仲倩維,馬愛軍,潘旭東,等.缺血性卒中不同亞型患者血漿miRNAs表達(dá)譜變化分析[J].中華神經(jīng)科雜志,2015,48(2):114-119.

[10]陳 烜,侯玉立,李偉榮,等.血漿miRNAs在急性病理期缺血性腦卒中的表達(dá)譜分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2015,13(7):932-934.

Bioinformatics study of microRNA in peripheral blood of patients with ischemic stroke

HURui-ting1,OUShi-ning1,QINDong-hua1,QINChao2

(1TheSecondDepartmentofNeurology,AffiliatedMinzuHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530001,China;2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To analyze the target genes of peripheral blood microRNA(miRNA) in patients with ischemic stroke,and to investigate their function and the role in the disease by bioinformatics analysis.Methods Microarray data of ischemic stroke were retrieved from GEO database,and the miRNAs with differential expression were screened by bioinformatics tools.Then the target genes of miRNAs with differential expression were analyzed.Gene ontology analysis and signal pathway analysis were performed in the target genes of miRNAs.miRNA network and miRNA-targeted gene network were established.Results Data were obtained from GSE55937 and 50 differential expressed miRNA were screened.A total of 7557 target gene sets of screened miRNA were obtained.The functions of these target genes mainly included DNA-dependent transcription and DNA-dependent regulation of transcription,ect.,mainly distributed in mitogen-activated protein kinase signal pathway and cancer signal pathway,ect..miRNA network analysis and miRNA-targeted gene network analysis revealed that homo sapiens-miRNA(hsa-miR)-15a-5p,hsa-miR-106b-5p,hsa-let-7c-5p,hsa-let-7i-5p and hsa-let-7g-5p were cored in the network.Conclusion Differential expressed miRNAs exist in the peripheral blood of patients with ischemic stroke,and hsa-miR-15a-5p,hsa-miR-106b-5p,hsa-let-7c-5p,hsa-let-7i-5p and hsa-let-7g-5p are closely associated with the pathogenesis of ischemic stroke.

Ischemic stroke,MicroRNA,Bioinformatics

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360191)；廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2015105)

胡瑞婷(1985～)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管病診治。

R 743.3

A

0253-4304(2016)06-0759-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.02

2016-01-25

2016-04-07)