張繼媛 劉金福,2肖 萍,2 劉紫萱

(1. 天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津 300384)

三種植物提取物對Ⅱ型糖尿病小鼠糖脂代謝改善作用研究

張繼媛1劉金福1,2肖 萍1,2劉紫萱1

(1. 天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津 300384)

通過建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，以血糖值的變化確定南瓜多糖、葛根黃酮、普洱茶褐素提取物降血糖的最佳劑量。在該基礎上，通過對其空腹血糖值(FBG)、胰島素(INS)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)的測定，表明3種提取物單一組分及兩兩聯(lián)合對Ⅱ 型糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂均有明顯的改善作用，在FBG、INS、IR、HDL、LDL指標上聯(lián)合組顯著優(yōu)于單一組分(P<0.05)。析因分析結(jié)果表明，當3種物質(zhì)兩兩聯(lián)合時具有交互作用；協(xié)同試驗發(fā)現(xiàn)，南瓜多糖與葛根黃酮聯(lián)合或與茶褐素聯(lián)合在降低TG含量上均與多糖組差異顯著(P<0.05)；茶褐素與葛根黃酮聯(lián)合在降低FBG、TC、LDL含量上效果顯著優(yōu)于黃酮組，在TG、INS方面效果顯著優(yōu)于茶褐素組和黃酮組(P<0.05)。分子機制試驗表明，3種物質(zhì)單一組分和兩兩聯(lián)合在PI3K/Akt蛋白通路表達方面均有增強作用。

南瓜多糖；葛根黃酮；普洱茶褐素；Ⅱ型糖尿??；聯(lián)合作用；PI3K/Akt通路

Ⅱ型糖尿病是一種典型的代謝異常疾病，糖脂代謝紊亂形成的糖、脂毒性在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用，而且糖、脂代謝紊亂常常互相影響，形成惡性循環(huán)[1]。近年來，人們對天然植物中所含有的多種生物活性成分改善 Ⅱ 型糖尿病動物模型糖脂代謝的效果有諸多報道，大量的試驗研究結(jié)果表明茶褐素[2]、葛根黃酮[3-4]、南瓜多糖[5]具有明顯的改善糖脂代謝紊亂的效果。并且針對不同活性成分在降脂、降糖作用機制方面表現(xiàn)出多靶點、多通路的特點，已有研究[6-8]表明多成分聯(lián)合使用具有更加明顯的改善糖脂代謝作用。磷脂酰肌醇3磷酸激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3K/Akt)，是胰島素調(diào)控細胞代謝的關鍵信號通路。PI3K磷酸化后產(chǎn)生的第二信可以活化Akt因子，影響肝臟、脂肪等組織對葡萄糖的攝取、胞內(nèi)糖原的合成及肝臟葡萄糖異生及輸出等[9-11]。已有研究[12]表明，在發(fā)生胰島素抵抗時，肝臟、肌肉以及脂肪等胰島素器官組織中的PI3K及Akt活性及含量均發(fā)生明顯下調(diào)現(xiàn)象。

本試驗擬對Ⅱ型糖尿病小鼠進行不同劑量的南瓜多糖、葛根黃酮、普洱茶茶褐素灌胃處理，確定單一成分的有效劑量，在此基礎上進行析因分析和協(xié)同作用試驗[13]，并對肝臟中PI3K/Akt分子通路上關鍵蛋白(PI3K p110和p-Akt T308)的表達進行分析，探討3種物質(zhì)單一及聯(lián)合對改善Ⅱ型糖尿病糖脂代謝的效果及機制，旨在為營養(yǎng)保健食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料

南瓜多糖提取物：總糖64.9%，其中多糖含量為48.3%，水分8%，果膠12%，實驗室自制；

普洱茶褐素提取物：茶褐素含量53%，蛋白質(zhì)24.8%，水分6.3%，天津天士力集團有限公司；

葛根黃酮：總黃酮含量78%，水分3.8%，灰分3.7%，安康康元醫(yī)藥科技有限公司；

昆明種雄性小鼠：清潔級，20～22 g，北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；

高脂飼料(含78.8%基礎飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽)、基礎飼料：北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑

膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)測試盒：中生北控生物科技股份有限公司；

鏈脲佐菌素(STZ)、羊抗兔二抗：北京索萊寶公司；

內(nèi)參β-actin、一抗為兔抗IgG(P 110)、一抗為兔抗IgG(T-308)：武漢愛博泰克生物科技有限公司；

乙醚、葡萄糖、甲醛、乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

可見分光光度計：752型，上海菁華科技儀器有限公司；

血糖儀：穩(wěn)豪倍易型，北京怡成生物電子技術有限公司；

魅力全自動生化儀：GLAMOUR3000型，美國MD儀器公司；

超低溫冰箱：8925型，美國Thermo公司；

電泳儀：JY600+型，美國Bio-Rad公司；

電泳槽：JY-SP-DT，美國Bio-Rad公司；

轉(zhuǎn)膜電泳儀：DYCZ-40D型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像分析系統(tǒng)：chemiDocTMXRS+型，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 高糖動物模型建立、分組及給藥方法 112只健康清潔級昆明種雄性小鼠，體重約20～22 g。適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為14組，每組8只。分別為正常組、模型組、南瓜多糖組(62.5，125，250，500 mg/kg)，葛根黃酮組(50，100，200，400 mg/kg)，普洱茶褐素組(225，450，900，1 350 mg/kg)(劑量為給藥劑量)。正常組飼喂基礎飼料，其余各組飼喂高脂飼料，4周后除正常組外，其余各組均禁食不禁水12 h，連續(xù)3 d腹腔注射鏈脲霉素(STZ)35 mg/kg，1周后禁食禁水24 h，測定空腹血糖，血糖值大于11.0 mmol/L為T2DM模型小鼠，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，并進行提取物灌胃4周。

1.2.2 聯(lián)合作用分組及給藥方法 采用了高脂飼料喂養(yǎng)與STZ注射結(jié)合的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，聯(lián)合組分組為南瓜多糖與葛根黃酮聯(lián)合組、南瓜多糖與茶褐素聯(lián)合組、茶褐素與葛根黃酮聯(lián)合組。劑量是通過量效關系得出最佳劑量。

1.2.3 指標觀察及測定

(1) 血糖值測定：鼠尾末端取血，用血糖儀測定血糖值。

(2) 血清指標測定：末次給藥禁食12 h，乙醚麻醉后，摘眼球取血，所取血液4 ℃靜置20 min，12 000 r/min離心20 min，吸出上清液即為血清，用全自動生化儀測定血清TC、TG、HDL、LDL的含量；用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法測定空腹胰島素(FINS)的含量和空腹血糖(FBG)，并按式(1)計算穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗(HOMA-IR)指數(shù)。

(1)

式中：

H——胰島素抵抗(HOMA-IR)指數(shù)；

A——空腹胰島素(FINS)的含量，mU/L；

B——空腹血糖(FBG)，mmol/L。

1.2.4 免疫印跡試驗 設立正常組、模型組、南瓜多糖組、葛根黃酮組、茶褐素組、多糖黃酮聯(lián)合組(聯(lián)合1組)、多糖茶褐素聯(lián)合組(聯(lián)合2組)、黃酮茶褐素聯(lián)合組(聯(lián)合3組)。

提取肝組織蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，經(jīng)10%分離膠和4%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳分離蛋白。在4 ℃下，采用濕轉(zhuǎn)法，用含有5%脫脂奶粉TBST封閉，按1∶3 000稀釋一抗(P 110或T-308)，4 ℃孵育過夜。洗膜，按1∶1 000稀釋二抗，室溫1 h，洗滌，與ECL顯色液反應5 min，曝光。利用凝膠成像進行定量分析，計算蛋白條帶與β-actin的光密度比值。

1.2.5 2×2析因設計和協(xié)同試驗設計 按照2×2析因設計條件，選取2種提取物2個劑量水平及其組合進行2種提取物在糖脂指標上是否存在交互作用；協(xié)同試驗設計采用2種提取物之間單一成分有效劑量組合與2倍單一成分有效劑量試驗組進行組間各糖脂生化指標比較，分析是否存在協(xié)同作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜多糖、葛根黃酮、普洱茶褐素與血糖血脂指標量效關系

通過3種物質(zhì)4種不同劑量的灌胃效果求出3種物質(zhì)的量效關系見圖1～6。圖1～3中，橫坐標為不同劑量下的南瓜多糖(pumpkin polysaccharide)、葛根黃酮(pueraria flavonoids)、茶褐素(pu-erh theabrowns)干預下的空腹血糖(單位為mmol/L)、胰島素(單位為mU/L)及胰島素抵抗，縱坐標ELISA試劑盒得到的數(shù)值；圖4～6中，橫坐標為不同劑量下的南瓜多糖(pumpkin polysaccharide)、葛根黃酮(pueraria flavonoids)、茶褐素(pu-erh theabrowns)干預下的膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白(單位為mmol/L)，縱坐標為生化儀得到的數(shù)值。

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 1 Relationship between of four does different between pumpkin polysaccharide and Blood Glucose Index

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 2 Relationship between of four does different different pueraria flavonoids and Blood Glucose Index

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 3 Relationship between of four does different pu-erh theabrowns and Blood Glucose Index

由圖1、2、4、5可知，隨著不同劑量的增加，南瓜多糖和葛根黃酮改善糖脂代謝的效果越好，分別在250 mg/kg和200 mg/kg劑量時各指標與模型組差異顯著。而圖3、6表明隨著茶褐素濃度的增加其改善糖脂代謝的效果越好，在劑量為450 mg/kg時，各指標與模型組差異顯著，但隨著劑量不斷增加最高劑量的效果反而下降，證明1 350 mg/kg茶褐素超出了其有效劑量，不能良好改善Ⅱ型糖尿病病癥，所以高劑量的茶褐素反而不會良好地改善糖脂指標。試驗表明，南瓜多糖、葛根黃酮、茶褐素這3種物質(zhì)對降低血糖血脂具有量效關系。通過上述量效關系試驗結(jié)果，本試驗選取南瓜多糖250 mg/kg，葛根黃酮200 mg/kg，茶褐素450 mg/kg有效劑量用于聯(lián)合作用試驗，探究南瓜多糖、葛根黃酮、茶褐素的交互協(xié)同作用。

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 4 Relationship between of four does different pumpkin polysaccharide and Blood lipid index

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 5 Relationship between of four does different pueraria flavonoids and Blood lipid index

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 6 Relationship between of four does different pu-erh theabrowns and Blood lipid index

2.2 2×2析因設計與結(jié)果分析

采用2×2析因設計，對小鼠進行250 mg/kg南瓜多糖、200 mg/kg葛根黃酮、450 mg/kg茶褐素及兩兩物質(zhì)聯(lián)合灌胃試驗，分析是否有交互作用。析因分析結(jié)果見表1～3。

采用析因分析方法，當P<0.05時，兩物質(zhì)聯(lián)合時具有交互作用。由表1～3可知，當南瓜多糖與葛根黃酮聯(lián)合時，在改善FBG、INS、IR、TC、HDL、LDL指標方面具有交互作用，黃酮貢獻率較多糖大(F多糖>F黃酮)；當南瓜多糖與茶褐素聯(lián)合時，所有糖脂代謝指標均存在著交互作用，且茶褐素較多糖貢獻率大(F茶褐素>F多糖)；當茶褐素與葛根黃酮聯(lián)合時，在INS、TC、HDL、LDL指標上具有交互作用，且對于INS茶褐素貢獻率大，TC、HDL、LDL 3個血脂指標黃酮較茶褐素貢獻率大(F茶褐素

表1 單一組分與聯(lián)合組分FBG、INS、IR、TG、TC、HDL、LDL的析因分析結(jié)果?

? #表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05。

表2 單一組分與聯(lián)合組分FBG、INS、IR、TG、TC、HDL、LDL的析因分析結(jié)果?

組別FBG/(mmol·L-1)INS/(mU·L-1)IRTG/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)模型組17.82±2.25#13.05±0.45#10.77±0.15#2.73±0.89#6.23±0.92#0.87±0.12#2.10±0.20#南瓜多糖組12.42±1.93*9.44±0.42*5.21±0.96*1.85±0.26*4.78±0.60*1.31±0.08*1.32±0.05*茶褐素組9.26±1.82*8.82±0.13*3.63±0.71*1.85±0.47*4.39±0.09*1.46±0.13*1.14±0.05*糖+茶褐素組9.40±1.76#*8.01±0.17#*3.35±0.09#*1.38±0.09*4.12±0.09*1.62±0.14#*0.95±0.11#*F多糖值1.765258.0942.8520.6940.69416.98629.764F茶褐素值2.352476.7304.9421.2838.83283.056113.936P值0.0000.0000.0010.0000.0000.0000.000

? #表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05。

表3 單一組分與聯(lián)合組分FBG、INS、IR、TG、TC、HDL、LDL的析因分析結(jié)果?

? #表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05。

2.3 南瓜多糖、葛根黃酮、普洱茶褐素提取物協(xié)同作用與分析

選取南瓜多糖劑量為500 mg/kg、葛根黃酮為400 mg/kg、茶褐素為900 mg/kg、多糖黃酮組為250 mg/kg南瓜多糖與200 mg/kg葛根黃酮、多糖茶褐素組為250 mg/kg南瓜多糖與450 mg/kg茶褐素、黃酮茶褐素組為200 mg/kg葛根黃酮與450 mg/kg茶褐素，進行小鼠灌胃試驗，結(jié)果見表4、5。

由表4、5可知，多糖黃酮和多糖茶褐素在降低TG含量上均與南瓜多糖單一組分差異顯著(P<0.05)；黃酮茶褐素組在降低FBG、TC、LDL含量上效果顯著優(yōu)于葛根黃酮單一組分組，在TG、INS方面效果顯著優(yōu)于普洱茶褐素和葛根黃酮單一組分(P<0.05)。通過上述析因分析設計試驗和協(xié)同作用試驗結(jié)果進一步說明，不同的植物活性成分在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面表現(xiàn)出多靶點、多通路和不同靶點、不同通路，以及存在著量效關系和構(gòu)效關系等生物學特點，通過各個生理學指標、通路代表的生物學意義，可以挖掘和深入研究分子機制及其關聯(lián)性。

表4 單一組分與聯(lián)合組分FBG、INS、IR的協(xié)同分析結(jié)果?

? 同一列肩注不同字母表示差異顯著，P<0.05。

表5 單一組分與聯(lián)合組分TG、TC、HDL、LDL的協(xié)同分析結(jié)果?

組別TG/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)正常組0.83±0.09d3.14±0.18c1.71±0.24c0.43±0.08d模型組2.73±0.12a6.23±0.22a0.87±0.12a2.10±0.20a南瓜多糖組1.77±0.10b4.43±0.27b1.48±0.14b1.17±0.01b茶褐素組1.65±0.11bc4.20±0.04bc1.52±0.02b1.04±0.07bc葛根黃酮組1.70±0.10bc4.39±0.10bc1.46±0.09b1.13±0.16b糖+酮組1.43±0.12cd4.30±0.12bc1.51±0.03b1.03±0.15bc糖+茶褐素組1.38±0.09cd4.12±0.09bc1.62±0.14b0.95±0.11bc酮+茶褐素組1.33±0.15d3.73±0.12c1.57±0.16b0.92±0.19c

? 同一列肩注不同字母表示差異顯著，P<0.05。

2.4 南瓜多糖、葛根黃酮、茶褐素提取物對PI3K/Akt蛋白通路的作用效果

肝臟是胰島素抵抗發(fā)生的重要器官之一，肝細胞糖代謝的紊亂是發(fā)生胰島素抵抗的重要原因。因此，本試驗選取肝臟作為靶器官研究3種提取物單一組分及聯(lián)合組分對PI3K/Akt蛋白通路中PI3K(P110)和Akt(T-308)蛋白的表達，試驗劑量同2.3，結(jié)果見圖7～12。

圖7～12是正常組小鼠肝臟中PI3K(P110)和P-Akt(T 308)蛋白與內(nèi)參β-actin光密度比值即比率，有顯著差異(P<0.05)，說明糖尿病模型小鼠在PI3K/Akt蛋白通路上有明顯體現(xiàn)。葛根黃酮、南瓜多糖、茶褐素單獨干預后，PI3K(P110)和P-Akt(T 308)蛋白的表達增強，南瓜多糖、葛根黃酮、茶褐素單一和聯(lián)合組干預后，PI3K(P110)和P-Akt(T 308)蛋白增加明顯，單一組、聯(lián)合組與模型組之間存在差異性(P<0.05)，也就是說葛根黃酮、南瓜多糖、茶褐素聯(lián)合干預時可增加Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟組織PI3K/Akt信號通路中PI3K(P110)和P-Akt(T 308)蛋白的表達，比3種物質(zhì)單獨干預效果要好。

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 9 Effect of puerariae flavones pu-er theabrownin and combined expression of PI3K protein

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 10 Effect of pumpkin polysaccharides puerariae flavones and combined expression of P-Akt protein

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

#表示與正常組比較，P<0.05；*表示與模型組比較，P<0.05

Figure 12 Effect of puerariae flavones pu-er theabrownin and combined expression of P-Akt protein

3 結(jié)論

本試驗證實3種植物提取物兩兩聯(lián)合均能改善Ⅱ型糖尿病病癥，兩物質(zhì)協(xié)同作用優(yōu)于單一組分，當兩物質(zhì)聯(lián)合作用時，通過對緩解胰島素抵抗，進而改善血糖血脂，緩解糖脂代謝紊亂，在糖脂代謝方面200 mg/kg葛根黃酮與450 mg/kg茶褐素聯(lián)合效果最佳，其他兩個聯(lián)合組次之。

本試驗結(jié)果顯示，南瓜多糖、葛根黃酮、茶褐素兩兩聯(lián)合可增加Ⅱ型糖尿病模型小鼠肝臟組織PI3K/Akt蛋白信號通路中PI3K(p110)、p-Akt(T308)蛋白及磷酸化表達，促進肝臟組織胰島素信號傳遞的恢復，干預胰島素抵抗，從而改善Ⅱ型糖尿病病癥。這可能是其改善Ⅱ型糖尿病IR的重要分子機制。蛋白信號通路也有同樣的效果，更加證明3種植物提取物兩兩聯(lián)合使用在糖脂代謝的多個生理指標上具有交互作用和協(xié)同作用。

本試驗的不足之處應結(jié)合多個信號通路更加宏觀的分析南瓜多糖、葛根黃酮、茶褐素干預蛋白信號的傳遞。

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Binding and interaction effect of three kinds of plant extracts on Glycolipid Metabolism in Type Ⅱ Diabetic Mice

ZHANG Ji-yuan1LIUJin-fu1,2XIAOPing1,2LIUZi-xuan1

(1.FoodScienceandBioengineeringCollege,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China; 2.TianjinEngineeringandTechnologyResearchCenterofAgriculturalProductsProcessing,Tianjin300384,China)

In this paper, the type II diabetes model was established and the optimal dose of the pumpkin polysaccharide, pueraria flavonoids and pu-erh theabrowns were determined by measured blood glucose. On the basis, the fasting blood glucose (FBG), insulin (INS), insulin resistance (IR), high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (LDL) were also investigated. The FBG, INS, IR, HDL, LDL combined group was significantly better than the single component (P<0.05). The results revealed that the combinations of pumpkin polysaccharide and pu-erh theabrowns, pueraria flavonoids and pu-erh theabrowns were effective. However, the pumpkin polysaccharide factorial analyses showed that the interactions of the three substances were interactive. The synergistic experiment showed that pumpkin polysaccharide combined with Pueraria lobata flavonoids or combination with tea-flavonoid significantly reduced TG content (P<0.05). The combination of theaflavin and pueraria flavonoids in reducing the content of FBG, TC, LDL was significantly better than flavonoids, and the effect of TG and INS was better than that of thepueraria flavonoids and pu-erh theabrowns group (P<0.05). The molecular mechanism experiments showed that a single one and two of the three components played an important role in the expression of PI3K / Akt protein pathway.

pumpkin polysaccharide; pueraria flavonoids; pu-erh theabrowns; Type Ⅱ Diabetic; binding effect; PI3K/Akt pathway

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.031

天津市科技支撐計劃項目(編號：13ZCZDNC01800)；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(編號：14ZXNZNC00036)

張繼媛，女，天津農(nóng)學院在讀碩士研究生。

劉金福 (1961-)，男，天津農(nóng)學院教授，碩士。 E-mail：f123@tjau.edu.cn

2016-10-21