嚴(yán) 斌 劉麗婭 王延州 周閑容 周素梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

谷朊粉水解物對(duì)MTX誘導(dǎo)大鼠小腸炎癥的修復(fù)作用

嚴(yán) 斌 劉麗婭 王延州 周閑容 周素梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

通過(guò)MTX(氨甲蝶呤)誘導(dǎo)的大鼠小腸炎模型，探討富含谷氨酰胺的谷朊粉胰蛋白酶水解物對(duì)小腸粘膜損傷的修復(fù)作用。結(jié)果表明：水解物能顯著提高小腸炎大鼠的小腸粘膜重量、絨毛高度、隱窩深度以及小腸粘膜的蛋白和DNA含量，同時(shí)降低血漿中二胺氧化酶水平和提高小腸粘膜谷胱甘肽含量。表明谷朊粉胰蛋白酶水解物可以有效地緩解大鼠小腸炎的腸粘膜損傷癥狀。

谷氨酰胺；谷朊粉水解物；氨甲蝶呤；小腸炎；大鼠

谷氨酰胺(glutamine，Gln)，一種“條件性必需氨基酸”，在應(yīng)激狀態(tài)下作為腸上皮細(xì)胞的主要代謝前體主要在胃腸道進(jìn)行消耗[1]。Gln對(duì)接受全腸外營(yíng)養(yǎng)的手術(shù)患者防止腸粘膜萎縮、調(diào)節(jié)腸道炎癥和抗氧化反應(yīng)有積極的效果[2]。然而，游離態(tài)Gln具有有限的溶解度，在水溶液中不穩(wěn)定，在高溫下易分解為焦谷氨酸[3]。

富含Gln的肽類化合物穩(wěn)定，易于溶解，且只有N末端的Gln才能轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸[4]，因此Gln肽可作為游離態(tài)Gln的理想替代品。已有研究[5]證實(shí)Gln肽對(duì)預(yù)防大鼠肝腸器官損傷有積極作用。此外，一些研究也報(bào)道了KGF[6]、IGF-I[7]、乳清衍生生長(zhǎng)因子[8]和ω-3脂肪酸[9]等對(duì)腸粘膜改善的潛在作用。然而，這些化合物(包括化學(xué)合成肽)由于成本較高，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制[10]。

谷朊粉是小麥淀粉加工的副產(chǎn)品。近年來(lái)，隨著小麥淀粉加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，全世界谷朊粉年產(chǎn)量已達(dá)100萬(wàn)t[11]。雖然谷朊粉在歐洲和北美被報(bào)道為一種常見(jiàn)的食物過(guò)敏原，但在大多數(shù)亞洲國(guó)家由于其低患病率仍被廣泛用作食品原料[12]。天然的谷朊粉表現(xiàn)出獨(dú)特的粘彈性，在過(guò)去主要用于面包行業(yè)面粉的品質(zhì)改良。酶解可有效地提高谷朊粉的生物利用率和功能特性[13-15]。由于其低成本以及高Gln含量(約400 mg/g·蛋白)，可用來(lái)生產(chǎn)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)肽來(lái)作為Gln的理想替代品[13]。目前為止，谷朊粉水解物的多種生理功能已被報(bào)道[16]。

已有研究[17]表明，采用molsin酶和actinase酶水解谷朊粉得到的小麥低聚肽能有效抵抗化療誘發(fā)的大鼠小腸炎癥。堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解谷朊粉得到的小麥肽對(duì)小鼠小腸炎癥有明顯的修復(fù)作用[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[19]指出，由胰蛋白酶一步酶解法所制備的谷朊粉水解產(chǎn)物中Gln含量高達(dá)21.4%，具有調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎的作用。然而，該水解物對(duì)小腸炎癥是否具有類似的功效還未見(jiàn)報(bào)道。

氨甲喋呤(MTX)是治療癌癥的化療藥物之一，常見(jiàn)副作用是粘膜損傷。最近研究[20]表明，MTX會(huì)使小腸隱窩細(xì)胞的增殖受到抑制，由化療導(dǎo)致的大鼠小腸上皮損傷能通過(guò)絨毛和隱窩的高度以及絨毛狀態(tài)來(lái)鑒定。有報(bào)道[21]指出，Gln對(duì)MTX誘導(dǎo)的小腸粘膜損傷有一定修復(fù)作用。本試驗(yàn)擬采用富含Gln的谷朊粉胰蛋白酶水解物(WGH)，通過(guò)MTX誘導(dǎo)的Wistar大鼠小腸炎模型，探討WGH對(duì)大鼠小腸炎的調(diào)節(jié)作用，旨在挖掘谷朊粉的潛在利用價(jià)值，為小麥肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉胰蛋白酶水解物：實(shí)驗(yàn)室自制(蛋白含量86.83%，Gln含量21.4%)，酶解反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[19]；

胰蛋白酶：酶活250 U/g，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；

雄性Wistar大鼠：SPF級(jí)，(200±20) g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)鼠糧：含谷氨酸及谷氨酰胺約3%，含玉米淀粉40%，酪蛋白20%，大豆油7%，纖維素5%等，北京華阜康生物科技股份有限公司；

谷胱甘肽(GSH)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

大鼠二胺氧化酶(DAO)ELISA檢測(cè)試劑盒：美國(guó)R&D公司；

組織基因組DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；

分析天平：T-214型，北京市賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

凱氏定氮儀：Kieltec Analysister型，丹麥Foss公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1900型，北京普析通用儀器有限公司；

全自動(dòng)酶標(biāo)儀：BIO-RAD 680型，美國(guó)BIO-RAD公司；

高效液相色譜儀：1200型，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 將大鼠飼養(yǎng)于12 h燈照/黑暗交替，溫度(22±2) ℃，濕度(55±5)% 的環(huán)境下，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和水充足。在適應(yīng)環(huán)境4 d后，稱重并隨機(jī)分為3組：正常組(CONTR組)、模型組(MTX組)、樣品組(MTX-WGH組)，每組10只。給MTX組和MTX-WGH組大鼠連續(xù)4 d腹腔注射MTX藥物(3.5 mg/kg體重)，造成小腸炎，同時(shí)給CONTR組大鼠每天注射2.5 mL生理鹽水，另外MTX-WGH組大鼠每天灌胃WGH(4.35 g/kg體重)。第5天處死大鼠，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 小腸粘膜含量的測(cè)定 處死大鼠后取出小腸，從盲腸往上1 cm處剪取小腸1 cm，用于常規(guī)石蠟包埋切片，然后再向上剪取8 cm，經(jīng)冰鹽水漂洗濾干后，用玻片刮取粘膜組織，稱重，于-80 ℃下保存。

1.2.3 小腸粘膜組織形態(tài)的觀察和絨毛高度、隱窩深度的測(cè)定 取小腸1 cm浸泡于10%甲醛溶液，石蠟包埋、切片，進(jìn)行常規(guī) HE 染色。利用光學(xué)顯微鏡觀察小腸粘膜組織形態(tài)，采用醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)分析軟件對(duì)絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 小腸粘膜蛋白含量的測(cè)定 將小腸粘膜組織按1∶9的質(zhì)量比用生理鹽水稀釋成10%組織勻漿，采用Lorry法測(cè)定蛋白含量。

1.2.5 小腸粘膜DNA含量的測(cè)定 采用組織基因組DNA提取試劑盒測(cè)定小腸粘膜DNA含量。

1.2.6 小腸粘膜谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定 取10%小腸組織勻漿的上清液，采用南京建成GSH試劑盒測(cè)定小腸粘膜GSH含量。

1.2.7 血漿二胺氧化酶(DAO)含量的測(cè)定 采用大鼠二胺氧化酶ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血漿DAO含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 所得數(shù)據(jù)均以X±SD表示，采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小腸粘膜組織形態(tài)

小腸粘膜組織形態(tài)見(jiàn)圖1。CONTR組大鼠的小腸粘膜組織無(wú)明顯的病理學(xué)變化，小腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊；MTX組大鼠的小腸粘膜損傷嚴(yán)重，小腸絨毛明顯水腫，腸壁充血，結(jié)構(gòu)破壞，表明MTX導(dǎo)致了大鼠小腸上皮的損傷；與MTX組大鼠相比，MTX-WGH組大鼠小腸粘膜損傷較輕，結(jié)構(gòu)較清晰，排列較整齊。此結(jié)果與Gln修復(fù)MTX誘導(dǎo)的小腸粘膜損傷[21]現(xiàn)象相似，由此說(shuō)明WGH中的Gln肽對(duì)小腸炎大鼠粘膜結(jié)構(gòu)損傷也有明顯改善作用。

2.2 小腸粘膜的重量

小腸粘膜不僅在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收中扮演重要角色，同時(shí)是小腸抵御外界抗原和致病菌的有效屏障。由圖2可知，與CONTR組相比，MTX組大鼠小腸粘膜重量顯著減低(P<0.05)，這是由于MTX導(dǎo)致小腸上皮結(jié)構(gòu)破壞，部分粘膜脫落所致；而MTX-WGH組大鼠小腸粘膜重量顯著高于MTX組(P<0.05)，說(shuō)明WGH的攝入減輕了腸道炎癥大鼠小腸粘膜的脫落，這與Gln肽改善其粘膜結(jié)構(gòu)有關(guān)，小腸上皮損傷程度得到有效改善，機(jī)體抵抗外界抗原的能力得到提高。

圖1 小腸微觀切片

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 小腸絨毛高度

小腸是機(jī)體吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，小腸絨毛高度的縮短會(huì)使小腸吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力下降[22]。由圖3可知，與CONTR組相比，MTX組大鼠小腸絨毛高度明顯縮短(P<0.05)，降低了小腸吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力；而MTX-WGH組大鼠絨毛高度與MTX組相比有明顯增加(P<0.05)，WGH的攝入提高了小腸炎大鼠吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，改善了大鼠因MTX導(dǎo)致的小腸炎癥狀。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 小腸隱窩深度

小腸隱窩細(xì)胞在粘膜修復(fù)機(jī)制和維持小腸粘膜完整性上起著關(guān)鍵性作用。小腸隱窩深度反映了腸上皮細(xì)胞的生成率，與小腸健康程度直接相關(guān)[22]。由圖3可知，MTX組大鼠隱窩深度較CONTR組相比明顯變淺(P<0.05)，腸上皮細(xì)胞的生成率明顯降低；而MTX-WGH組大鼠隱窩深度明顯高于MTX組(P<0.05)，WGH的攝入緩解了MTX導(dǎo)致的小腸隱窩深度降低，提高了大鼠腸上皮細(xì)胞的生成率。

2.5 小腸粘膜的蛋白含量

小腸粘膜中的蛋白不僅維持著小腸粘膜的結(jié)構(gòu)，還與粘膜組織的生理生化活動(dòng)密切相關(guān)。由圖4可知，MTX組大鼠小腸粘膜的蛋白含量顯著低于CONTR組(P<0.05)；而MTX-WGH組大鼠小腸粘膜的蛋白含量與MTX組相比有顯著提高(P<0.05)。Gln能為組織蛋白的合成提供氮源，WGH的攝入尤其是其所含的Gln肽不僅緩解了小腸炎大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)的破壞，同時(shí)促進(jìn)了其粘膜組織蛋白的合成。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.6 小腸粘膜的DNA含量

Gln是腸粘膜的主要能源物質(zhì)及嘌呤合成的氮源供體，為DNA的合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。Gln由于提供了DNA復(fù)制的能量和核苷酸堿基而有助于腸道細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的維持[23]。由圖4可知，與CONTR組相比，MTX組大鼠的小腸粘膜DNA含量顯著降低(P<0.05)；而MTX-WGH組大鼠的小腸粘膜DNA含量與MTX組相比有明顯提高(P<0.05)。WGH中的Gln肽促進(jìn)了大鼠粘膜組織DNA的合成，緩解了大鼠因MTX導(dǎo)致粘膜DNA含量降低的現(xiàn)象。

2.7 小腸粘膜的GSH含量

GSH是組織中主要的非蛋白類含巰基化合物，參與自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的清除[24]。Gln是谷胱甘肽合成的前體物質(zhì)。研究[25]表明，腸外營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充Gln能夠增加大鼠腸缺血再灌注模型的粘膜GSH水平。由圖5可知，MTX組大鼠的小腸粘膜GSH含量與CONTR組相比顯著降低(P<0.05)；與MTX組相比，MTX-WGH組大鼠小腸粘膜GSH含量有明顯提高(P<0.05)，達(dá)到正常水平。Gln肽促進(jìn)了粘膜組織中GSH的合成，提高了小腸炎大鼠腸黏膜組織的抗氧化能力。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.8 血漿中DAO含量

DAO是哺乳動(dòng)物腸粘膜上皮細(xì)胞中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。據(jù)報(bào)道[26]，腸損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中DAO的釋放增加，然后促進(jìn)其進(jìn)入血液，增加血液中DAO含量。DAO含量的變化與腸道粘膜屏障功能受損情況密切相關(guān)，能作為反映腸損傷的敏感指標(biāo)[27]。由圖5可知，MTX顯著提高了大鼠血漿中DAO水平(P<0.05)，進(jìn)一步表明MTX導(dǎo)致了大鼠腸粘膜屏障功能受到了嚴(yán)重?fù)p傷；而MTX-WGH組與MTX組相比大鼠血漿DAO水平顯著降低(P<0.05)，表明WGH的攝入使大鼠腸粘膜屏障功能得到一定保護(hù)，使其受MTX的損傷得到有效緩解。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了谷朊粉胰蛋白酶水解物對(duì)MTX誘導(dǎo)的大鼠小腸炎的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，谷朊粉胰蛋白酶水解物對(duì)MTX誘導(dǎo)的小腸炎大鼠粘膜組織形態(tài)和生理生化指標(biāo)具有明顯的改善作用，能減輕粘膜損傷程度，促進(jìn)粘膜炎癥的恢復(fù)，該機(jī)制可能與水解物中的Gln肽促進(jìn)粘膜細(xì)胞增殖以及提高小腸粘膜谷胱甘肽含量有關(guān)。谷朊粉經(jīng)胰蛋白酶水解后可產(chǎn)生具有腸道活性的肽段，但其活性成分和作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Effect of wheat gluten hydrolysate on the recovery of intestinal mucositis in methotrexate treated rats

YAN BinLIULi-yaWANGYan-zhouZHOUXian-rongZHOUSu-mei

(InstituteofFoodScienceandTechnology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

To investigate the effect of wheat gluten hydrolysate(WGH) rich in glutamine prepared through the enzymatic hydrolysis by trysin on small intestinal mucosal by methotrexate induced mucositis model in rats. The results showed that the WGH can significantly increase intestinal mucosa weight, villus height, crypt depth, protein and DNA content, decrease diamine oxidase level in plasma and increase glutathione content of small intestine mucosa. The WGH can efficiently alleviate the intestinal mucosal injury in rats.

Glutamine; wheat gluten hydrolysate; methotrexate; intestinal mucositis; rats

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.032

農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”項(xiàng)目(編號(hào)：2016-X31)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(編號(hào)：201303071)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31571768)

嚴(yán)斌，男，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所在讀碩士研究生。

周素梅(1971-)，女，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所研究員，博士。E-mail:zhousumei@caas.cn

2016—10—24