劉小龍

（福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院，福建省肝病科學(xué)研究中心，福建福州市350000）

液體活檢在肝癌早期診斷與預(yù)后判斷中的臨床價(jià)值

劉小龍

（福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院，福建省肝病科學(xué)研究中心，福建福州市350000）

據(jù)統(tǒng)計(jì)中國(guó)肝癌死亡率為30.81/10萬(wàn)（2015年數(shù)據(jù)）[1]，居我國(guó)惡性腫瘤死因第三位。大部分肝癌病人在被確診時(shí)已處于中晚期且伴有不同程度的肝硬化，導(dǎo)致手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。目前蛋白質(zhì)類血清標(biāo)志物篩查（AFP/AFP-L3）及影像學(xué)診斷，是肝癌診斷以及判定術(shù)后（或介入治療后）復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或腫瘤負(fù)荷的主要手段[2]，但二者均存在靈敏度不高或特異性不足等問(wèn)題，使其不能為肝癌病人提供準(zhǔn)確的診斷及預(yù)后信息。

液體活檢作為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的重要手段，已成為腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的前沿研究熱點(diǎn)。液體活檢指檢測(cè)體液中捕獲到的游離腫瘤信息，進(jìn)而反映病人的全身腫瘤信息。與傳統(tǒng)的活檢技術(shù)相比，其具有多次低創(chuàng)傷反復(fù)采樣、可實(shí)時(shí)"更新反饋"腫瘤負(fù)荷、克服腫瘤異質(zhì)性、指導(dǎo)個(gè)性化用藥等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上蘊(yùn)藏著廣闊的應(yīng)用前景。目前液體活檢主要包括循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及外泌體檢測(cè)。

1 循環(huán)腫瘤DNA

游離脫氧核糖核酸(Cell Free DNA，cfDNA)是指存在血漿或血清、腦脊液等細(xì)胞外游離狀態(tài)的核酸片段，約160～180 bp，是細(xì)胞DNA在生理或病理?xiàng)l件下降解的產(chǎn)物。目前研究表明腫瘤病人外周血中存在的cfDNA顯著高于健康人群，并且這些cfDNA攜帶有患者的腫瘤相關(guān)基因信息（包括腫瘤基因的異常突變，甲基化和拷貝數(shù)異常等），稱之為循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。其主要來(lái)源于壞死的腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤細(xì)胞，凋亡的腫瘤細(xì)胞及來(lái)自于腫瘤細(xì)胞的外分泌小體。

現(xiàn)階段研究表明循環(huán)腫瘤DNA是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無(wú)創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)手段。在肝癌的發(fā)生發(fā)展階段，cfDNA的含量與腫瘤的發(fā)展情況和預(yù)后密切相關(guān)：cfDNA含量通常在肝癌晚期或者大肝癌患者中較高，而在肝癌早期或者小肝癌患者中較低；術(shù)后cfDNA含量較高的患者預(yù)后較差，更容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]。因此，肝癌患者血液中cfDNA的含量可用于肝癌的診斷和預(yù)后，但這個(gè)方法只計(jì)算總體cfDNA的濃度，并沒(méi)有區(qū)分ctDNA的遺傳改變特征，靈敏度和特異性并不高。而通過(guò)檢測(cè)肝癌患者血液中癌癥特異的基因突變或表觀遺傳學(xué)變化可以為肝癌的診斷提供更為精確的標(biāo)志物。如TP53基因作為一種經(jīng)典的抑癌基因，突變熱點(diǎn)少，穩(wěn)定性高，且該基因的第249位絲氨酸突變常發(fā)生于化學(xué)致癌物黃曲霉毒素誘發(fā)或乙肝病毒感染所引發(fā)的肝癌中，在肝癌發(fā)生早期即可檢出。因此血液中TP53基因第249位絲氨酸的ctDNA可作為肝癌早期診斷的標(biāo)志物[4-6]。此外，檢測(cè)外周血中ctDNA的表觀遺傳學(xué)變化可作為肝癌早期診斷的另一手段，如ctDNA中RASSF1A，p15和p16的甲基化檢測(cè)可作為肝癌診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)記物，檢測(cè)敏感度可達(dá)84%，特異度達(dá)94%，可比現(xiàn)在的檢測(cè)手段更早地診斷其患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，在臨床上精確檢測(cè)肝癌ctDNA的特異性變化已經(jīng)成為可能；根據(jù)肝癌病人的ctDNA信息分析，也可用于指導(dǎo)個(gè)性化用藥及治療療效的監(jiān)測(cè)等。

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells,CTCs）是指由于自發(fā)或診療操作使得一部分癌細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)灶進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到處游走，進(jìn)入血液循環(huán)的大部分癌細(xì)胞都會(huì)死亡，只有小部分高活力、高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞存活下來(lái)，它們相互聚集形成癌栓，在一定條件下轉(zhuǎn)移形成新的病發(fā)灶。

目前國(guó)際上主要采用FDA批準(zhǔn)臨床運(yùn)用的Cell Search系統(tǒng)，是基于上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM（Epithelial cell adhesion molecule)抗體的策略來(lái)分選富集CTCs[9]。臨床上定義外周血中CTCs≥2個(gè)/7.5 mL為CTCs陽(yáng)性[10]。CTCs檢測(cè)在肝癌早期診斷中具有重要意義，傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查只能檢測(cè)出直徑大于1 cm的腫瘤，而利用外周血中CTCs檢測(cè)的方法，腫瘤在只有1 mm左右時(shí)便可檢出。另外CTCs數(shù)量還是無(wú)病生存期（DFS）和總生存期(OS)的預(yù)測(cè)因子，CTCs數(shù)量越多，預(yù)后越差，生存期越短[11-12]。因而靶向CTCs可作為肝癌切除根治切除術(shù)的新輔助治療策略，殺死術(shù)后殘存的CTCs細(xì)胞，減少CTCs數(shù)量，可降低肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

3 外泌體

外泌體（Exosome）指一類由活細(xì)胞通過(guò)多泡體與細(xì)胞膜融合分泌至細(xì)胞外隙或體液中直徑為40～100 nm的小囊泡體，主要有蛋白質(zhì)、RNA、microRNA和DNA等，在細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等許多生理和病理過(guò)程方面發(fā)揮重要的作用[13-14]。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌外泌體影響腫瘤周邊的微環(huán)境及不同的受體細(xì)胞，如誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞，減少I型膠原蛋白的合成等進(jìn)而促進(jìn)癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明外泌體可以成為肝癌早期診斷及預(yù)后的一類新型標(biāo)志物。如外泌體中的microRNA（miR-718,miR-221,miR-191）等已經(jīng)被證明在肝癌病人血漿外泌體中的分布與正常人顯著不同[15-16]。它們可通過(guò)抑制下游靶基因的表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)移參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，可作為肝癌標(biāo)志物或治療靶標(biāo)。但現(xiàn)在對(duì)肝癌的外泌體研究還很有限，對(duì)外泌體如何參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 展望

隨著高通量測(cè)序、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等研究的進(jìn)展，液體活檢必將在肝癌診斷、預(yù)后判斷中發(fā)揮重要的作用。但目前將其應(yīng)用于臨床還有一些問(wèn)題需要解決：如循環(huán)腫瘤細(xì)胞尚無(wú)檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，靈敏度、特異度不足；還不清楚ctDNA與不同癌癥之間的關(guān)系，即使檢測(cè)到突變的ctDNA，但卻不知道其來(lái)源。基于CTCs、ctDNA、外泌體的檢測(cè)因其本身的特性而各有利弊，綜合利用上述手段將促進(jìn)肝癌的早期診斷及診療方案的實(shí)時(shí)精準(zhǔn)反饋與評(píng)估，進(jìn)一步降低肝癌的死亡率，提高其遠(yuǎn)期生存率。

1.Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

2.Wu S,Liew CT,Li X.Study on telomerase activity in hepatocellular carcinoma and chronic hepatitic disease[J]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi,1998,27(2):91-93.

3.Openshaw MR,Harvey RA,Sebire NJ,et al.Circulating Cell Free DNA in the Diagnosis of Trophoblastic Tumors [J].EBioMedicine,2016,4:146-152.

4.Gouas DA,Villar S,Ortiz-Cuaran S,et al.TP53 R249S mutation,genetic variations in HBX and risk of hepatocellular carcinoma in The Gambia[J].Carcinogenesis,2012, 33(6):1219-1224.

5.Kirk GD,Camus-Randon AM,Mendy M,et al.Ser-249 p53 mutations in plasma DNA of patients with hepatocellular carcinoma from The Gambia[J].J Natl Cancer Inst, 2000,92(2):148-153.

6.Kirk GD,Lesi OA,Mendy M,et al.249(ser)TP53 mutation in plasma DNA,hepatitis B viral infection,and risk of hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2005,24(38): 5858-5867.

7.Zhang YJ,Wu HC,Shen J,et al.Predicting hepatocellular carcinoma by detection of aberrant promoter methylation in serum DNA[J].Clin Cancer Res,2007,13(8):2378-2384.

8.Chan KC,Lai PB,Mok TS,et al.Quantitative analysis of circulating methylated DNA as a biomarker for hepatocellular carcinoma[J].Clin Chem,2008,54(9):1528-1536.

9.Zhang Y,Li J,Cao L,et al.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma:detection techniques,clinical implications,and future perspectives[J].Semin Oncol,2012, 39(4):449-460.

10.Sastre J,Maestro ML,Puente J,et al.Circulating tumor cells in colorectal cancer:correlation with clinical and pathological variables[J].Ann Oncol,2008,19(5):935-938.

11.Schulze K,Gasch C,Staufer K,et al.Presence of Ep-CAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int J Cancer,2013,133 (9):2165-2171.

12.Sun YF,Xu Y,Yang XR,et al.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection[J].Hepatology,2013,57(4):1458-1468.

13.Mittelbrunn M,Sanchez-Madrid F.Intercellular communication:diverse structures for exchange of genetic information[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(5):328-335.

14.Vlassov AV,Magdaleno S,Setterquist R,et al.Exosomes: current knowledge of their composition,biological functions,and diagnostic and therapeutic potentials[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820(7):940-948.

15.Sugimachi K,Matsumura T,Hirata H,et al.Identification of a bona fide microRNA biomarker in serum exosomes that predicts hepatocellular carcinoma recurrence after liver transplantation[J].Br J Cancer,2015,112(3):532-538.

16.Li J,Wang Y,Yu W,et al.Expression of serum miR-221 in human hepatocellular carcinoma and its prognostic significance[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,406 (1):70-73.

（2016-7-30收稿）

R446.11

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.004

劉小龍，男，博士生導(dǎo)師。E-mail:xiaoloong.liu@gmail.com