馬 晶 李錦玉?

血清miRNA-208和β-肌球蛋白重鏈在心力衰竭患者中的表達(dá)及其意義

馬 晶 李錦玉?

目的 檢測微小RNA（miRNA）-208及β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）在心力衰竭患者血清中的表達(dá)變化及相互關(guān)系。方法 收集因心力衰竭入院的患者60例（心力衰竭組）和健康體檢者56例（對照組），應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測血清中miRNA-208、β-MHC的表達(dá)，超聲心動圖評估左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）情況。結(jié)果 心力衰竭組血清中miRNA-208、β-MHC表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。miRNA-208表達(dá)水平與LVMI呈正相關(guān)（P＜0.05），與LVEF呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。β-MHC與miRNA-208表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 心力衰竭患者miRNA-208表達(dá)增高及相應(yīng)的正向上調(diào)β-MHC水平可能是心力衰竭心肌重構(gòu)的機(jī)制之一，與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

心力衰竭 微小RNA 肌球蛋白重鏈 左室質(zhì)量指數(shù)

心臟負(fù)荷增加、氧化應(yīng)激反應(yīng)等均可導(dǎo)致心室重構(gòu)。β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）是心臟最主要參與收縮功能的蛋白。微小RNA（miRNA）是一類非編碼單鏈RNA分子，廣泛而穩(wěn)定的存在于人類細(xì)胞外液中，可與mRNA特定位點結(jié)合，抑制特定的靶基因，從而參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與多種心血管疾病病理生理進(jìn)程的發(fā)生發(fā)展。miRNA-208是目前發(fā)現(xiàn)唯一的心臟特異性表達(dá)的miRNA，其可通過調(diào)控β-MHC參與心肌代謝進(jìn)程。本研究測定心力衰竭患者和健康人群血清中miRNA-208、β-MHC表達(dá)水平，評估左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），探討心力衰竭患者血清中miRNA-208與β-MHC的表達(dá)水平改變與心室重構(gòu)的關(guān)系，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2015年8月至2016年1月在本院心內(nèi)科住院的心力衰竭患者60例為心力衰竭組，其中男39例，女21例，平均年齡（68.42±7.73）歲。其中擴(kuò)張型心肌病16例，冠心病15例，高血壓性心臟病15例，風(fēng)濕性心臟病14例。均符合美國紐約心臟病協(xié)會（NYHA）心功能分級II～I(xiàn)V級，且心臟彩色多普勒超聲檢查確診心功能不全。另選擇同期本院健康體檢者56例為對照組，其中男40例，女16例，平均年齡（67.29±6.72）歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無胸悶胸痛氣促史，體檢正常，血壓、心電圖、血糖、血脂、心臟超聲正常者。兩組在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)等臨床資料的基線特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。兩組受檢者均為自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）標(biāo)本收集及儲存：采集晨時空腹＞12h肘靜脈血6ml，按照RNA提取試劑盒說明離心取血清，儲存于-80℃冰箱中備用。（2）檢測方法：miRNA-208、β-MHC的測定采用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的ABI7500的實時熒光定量PCR儀，按照試劑盒說明書提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行定量PCR檢測miRNA-208、β-MHC表達(dá)水平，U6作為內(nèi)參，使用相對定量方法（2-ΔΔCt）計算miRNA-208、β-MHC表達(dá)量。miRNA-208上游引物為5'-GTCAGTTTGTCAAATACC-3'，下游引物為5'GAGCAGGCTGGAGAATAG3'。β-MHC上游引物為5' GTGCGACAACACTTATGA3'，下游引物為5' AAACAGCCGTCCTGAGAT3'。采用Aspen彩色多普勒超聲儀器，觀察對象左側(cè)臥位，心臟超聲測量左心室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、舒張末期室間隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）。左室質(zhì)量（LVM）的計算采用Devereux等推薦的公式［1］：LVM（g）=0.832［（LVEDD+IVST+LVPWT）3-LVEDD3］±0.6；體表面積（BSA）=0.0061×身高（cm）+0.0128×體質(zhì)量（kg）-0.1529。LVMI（g/m2）=LVM/BSA。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。兩兩相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中miRNA-208、β-MHC表達(dá)水平比較 心力衰竭組血清中microRNA-208、β-MHC表達(dá)水平較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 兩組血清微小RNA-208、β-MHC表達(dá)水平、LVMI、LVEF比較（x±s）

2.2 血清miRNA-208表達(dá)水平與左室質(zhì)量指數(shù)、心功能相關(guān)性分析 相關(guān)分析顯示，microRNA-208表達(dá)水平與左室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.439，P＜0.05），與LVEF呈負(fù)相關(guān)（r=-0.324，P＜0.05）。

2.3 血清β-MHC表達(dá)水平與左室質(zhì)量指數(shù)、心功能相關(guān)性分析 β-MHC表達(dá)水平與左室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.416，P＜0.05），與LVEF呈負(fù)相關(guān)（r=-0.320，P＜0.05）。

2.4 血清β-MHC與miRNA-208表達(dá)水平相關(guān)性分析 β-MHC與miRNA-208表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.376，P＜0.05）。

3 討論

微小RNA是基因非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈小分子RNA，由含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體剪切而成。從1993年Lee等發(fā)現(xiàn)第一個miRNA至2008年引入生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域，其迅速成為研究的熱點，有望成為新一代心血管疾病的生物標(biāo)志物，評估心血管疾病診療預(yù)后。mRNA有2～7個核苷酸可識別結(jié)合miRNA，尤其是3'端非翻譯區(qū)上核苷酸序列，與miRNA結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控［2］，參與心血管系統(tǒng)疾病的多種病理生理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、纖維化、衰老及癌變等。在動脈粥樣硬化斑塊形成中，miRNA可分別調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化、增值、遷移［3］。心力衰竭作為各種心血管疾病進(jìn)展的終末階段，有著復(fù)雜的病理生理改變。心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。miRNA-208是心臟特異性miRNA，在血液中含量穩(wěn)定，調(diào)控心血管細(xì)胞的生成、發(fā)育、損傷修復(fù)等心血管生理病理過程。Wilson KD等［4］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1、miRNA-133和miRNA-208高表達(dá)于人類胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞和胎兒心臟。心肌梗死后數(shù)小時內(nèi)有多種miRNAs表達(dá)升高，如miRNA-1，miRNA-33，miRNA-499和miRNA-208a等［5］。既往研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠的miR-208表達(dá)下調(diào)，可能與心梗后心室重構(gòu)相關(guān)。本資料中比較了心力衰竭患者與對照組，結(jié)果顯示，心力衰竭組的血清miRNA-208表達(dá)水平較對照組顯著升高，提示miRNA-208與心力衰竭可能存在相關(guān)關(guān)系。miRNA-208表達(dá)水平與左室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)，提示miRNA-208與左室重構(gòu)有正相關(guān)性，可能參與了心力衰竭患者的解剖重構(gòu)。

肌球蛋白是心肌重要的收縮蛋白，由兩條重鏈（α-MHC，β-MHC）和四條輕鏈組成，在心肌肥厚的發(fā)生過程中起重要作用。心肌肌球蛋白重鏈表達(dá)產(chǎn)物有三種二聚體，即α-α同二聚體（Vl型）、αβ-異二聚體（V2型）和β-β同二聚體（V3型），V1型收縮活性最強(qiáng)，V3型收縮活動最低。心肌肥厚與肌球蛋白“胚胎化”密切相關(guān)，即肌球蛋白重鏈α基因表達(dá)下調(diào)伴隨著肌球蛋白重鏈β基因表達(dá)上調(diào)，表達(dá)產(chǎn)物由Vl型向V3型轉(zhuǎn)化，心肌收縮力下降，這一過程受多種微小核糖核酸調(diào)控。Krieger等［6］報道，微囊素-1基因敲除致自發(fā)性心肌肥厚大鼠模型中，其心肌β-MHC表達(dá)增加。心肌肥厚與MHC基因表達(dá)的轉(zhuǎn)變有關(guān)［7］。大鼠心肌細(xì)胞miRNA-208a過表達(dá)時，β-MHC蛋白表達(dá)也相應(yīng)增加［8］。miRNA-208缺失突變的動物在甲狀腺素作用下心臟中的β-MHC不會過度表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)miRNA-208缺失的小鼠出生前β-MHC并未有明顯變化，miRNA-208對β-MHC的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為出生后調(diào)節(jié)［9］。本研究比較了心力衰竭患者與對照組的β-MHC表達(dá)水平，研究顯示，血清中β-MHC表達(dá)水平在心力衰竭組中顯著升高，β-MHC表達(dá)水平與左室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)，提示β-MHC與左室重構(gòu)有正相關(guān)性，可能參與心力衰竭患者的解剖重構(gòu)。miRNA-208與β-MHC表達(dá)水平呈正相關(guān)，二者均與LVEF呈負(fù)相關(guān)，提示miRNA-208可能通過介導(dǎo)β-MHC正向上調(diào)參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。β-MHC的表達(dá)上調(diào)使表達(dá)產(chǎn)物由Vl型向V3型轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致心肌收縮力下降，加重心肌重構(gòu)及心功能的惡化。

總之，miRNA-208表達(dá)水平在心力衰竭組中顯著升高，并與左心室質(zhì)量指數(shù)相關(guān)，miRNA-208可能參與心力衰竭患者的解剖重構(gòu)，是心力衰竭心肌重構(gòu)的機(jī)制之一，測定miRNA-208可反映心肌重構(gòu)的程度。心力衰竭患者血清miRNA-208過度表達(dá)，相應(yīng)的介導(dǎo)β-MHC正向上調(diào)，從而參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展及心功能的惡化，miRNA-208將可能是心力衰竭診斷的新的定量生物標(biāo)記物及潛在的治療靶點。

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Objective To investigate change and relationship of microRNA-208（miRNA-208）and β myosin heavy chain（β-MHC）expressions in patients with heart failure. Method There were 60 patients being defnitely diagnosed heart failure and 56 healthy controls to be selected. Quantitative real time polymerase chain reaction was applied to assess expressions of miRNA-208 and β-MHC. Transthoracic echocardiographic examination were performed to assess the left ventricular mass index（LVMI）and the left ventricular ejection fraction（LVEF）. Results The expressions of miRNA-208 and β-MHC markedly increased in heart failure Compared with normal subject. The expressions of miRNA-208 and β-MHC were positively correlated with the LVMI（P＜0.05）and negatively with LVEF（P＜0.05）. The expressions of miRNA-208 were positively correlated with the expressions of β-MHC（P＜0.05）. Conclusion Expression of miRNA-208 level was signifcantly up-regulated in human patients with heart failure，possibly contributing to up-regulation of β-MHC leading to the development of heart failure. These results provide potential new insights into molecular mechanisms of heart failure.

Chronic heart failure MicroRNA Myosin heavy chain Left ventricular mass index

201399 上海市浦東醫(yī)院（復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院）

*通信作者