丘玥，魏敏，王之遙，黃宇光

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京100730

RhoA/Rho激酶信號通路在慢性疼痛中的作用

丘玥，魏敏，王之遙，黃宇光

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京100730

慢性疼痛;Rho蛋白;Rho激酶;抑制劑;鎮(zhèn)痛

RhoA是一種小分子G蛋白，RhoA的主要效應(yīng)底物Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases，ROCK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要在細胞遷移、分化和生存等方面起重要作用［1］。RhoA/ROCK的異常激活可在很多疾病中被觀察到，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤等。目前大量研究表明，RhoA/ ROCK通過其介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)在慢性疼痛中也發(fā)揮著重要作用。本文通過闡述RhoA/ROCK信號通路在慢性疼痛中的作用機制，為臨床治療疼痛提供新的思路和策略。

RhoA/Rho激酶通路

Rho GTP酶

Rho GTP酶是Ras GTP酶超家族的一個亞家族，通過在失活(GDP-結(jié)合)和激活(GTP-結(jié)合)狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換精確調(diào)控多條信號通路。其在激活和失活狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換主要由以下幾類蛋白調(diào)控:GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)、鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子(guanine nucleotide-exchange factors，GEFs)和鳥嘌呤核苷酸分離抑制因子(guanine nucleotide-dissociation inhibitors，GDIs)。GAPs主要增強內(nèi)源性GTP酶的活性，GEFs主要催化GDP結(jié)合態(tài)到GTP結(jié)合態(tài)的轉(zhuǎn)換，GDIs則將GTP酶以GDP結(jié)合的失活狀態(tài)隔絕在胞漿內(nèi)。

其中，RhoA是小分子G蛋白家族的一個成員，在許多細胞功能中起到重要作用，包括細胞骨架重排，細胞運動、吞噬、轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控以及細胞的生長［2］。

Rho激酶

ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要有2種異構(gòu)體:ROCKⅠ和ROCKⅡ。2種異構(gòu)體在總氨基酸序列上有約65%的重疊，其中激酶端重疊達92%。盡管兩種異構(gòu)體在蛋白序列上高度相似，組織分布卻有所不同。ROCKⅠ主要表達在非神經(jīng)組織中，如心臟、肺、骨骼肌，而ROCKⅡ則主要在腦組織中高表達［3］。

ROCK的活性受起C端負性調(diào)節(jié)，在失活狀態(tài)下，C端區(qū)域反折遮蓋激酶區(qū)，從而形成自身抑制的環(huán)形結(jié)構(gòu)［4］。當(dāng)GTP結(jié)合狀態(tài)的Rho與ROCK的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合時，ROCK的自身抑制狀態(tài)改變，從而激酶活化。其他可激活ROCK的信號包括花生四烯酸、鞘氨醇磷脂等，它們對ROCK的激活不依賴Rho蛋白［5］。

ROCK的激活主要通過對目標(biāo)蛋白的磷酸化。其中一個主要的底物是肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)。RhoA/ROCK介導(dǎo)的MLC磷酸化引起肌球蛋白與肌動蛋白相互作用，從而引起細胞骨架重排等一系列改變［6］。此外，ROCK可以通過使MLC磷酸酶失活從而間接調(diào)節(jié)MLC磷酸化的量。ROCK的其他底物包括絲氨酸/蘇氨酸激酶LIM激酶1和2［7］、中間絲蛋白(例如波形蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、神經(jīng)絲)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein，MAP2)、tau蛋白和腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2 (collapsin response mediator protein 2，CRMP2)等。

RhoA/Rho激酶通路抑制劑

Fasudil和Y-27632是最早發(fā)現(xiàn)的ROCK抑制劑，主要通過拮抗細胞內(nèi)鈣發(fā)揮作用。考慮到不同ROCKⅠ和ROCKⅡ序列的高度相似性，目前還沒有ROCK選擇拮抗劑。此外，H-1152、AS1892802等較強的ROCK拮抗劑也在基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用。

HMG-CoA還原酶抑制劑對RhoA/ROCK通路也有抑制作用。HMG-CoA還原酶抑制劑調(diào)節(jié)了許多小分子G蛋白的功能，例如Ras、Rho、Rab、Rac、Ral和Rap［8］。以往研究表明，他汀類藥物通過抑制HMGCoA還原酶活性，降低了類異戊二烯的含量。類異戊二烯是包括小GTP結(jié)合蛋白的許多蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾中一種重要的脂質(zhì)連接物質(zhì)，可協(xié)助這些蛋白質(zhì)從胞質(zhì)到胞膜的轉(zhuǎn)位。甲羥戊酸是類異戊二烯的前體，為驗證類異戊二烯在小分子G蛋白激活中的作用，Ohsawa等［9］發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射甲羥戊酸可誘發(fā)熱痛敏;鞘內(nèi)預(yù)注射ROCK抑制劑Y-27632可完全拮抗甲羥戊酸誘發(fā)的熱痛敏，而甲羥戊酸誘發(fā)熱痛敏僅可被尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑FTI-277部分拮抗。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射甲羥戊酸可增加脊髓內(nèi)RhoA從胞質(zhì)到胞膜的轉(zhuǎn)移，而用HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀可緩解福爾馬林誘導(dǎo)的二相疼痛反應(yīng)。

RhoA/Rho激酶通路與疼痛

在神經(jīng)系統(tǒng)中，RhoA信號的活化參與了突觸可塑性的形成。在軸突的延伸、樹突結(jié)構(gòu)重塑及海馬神經(jīng)元長時程增強的形成中，RhoA都扮演重要角色。RhoA/ROCK通路參與了慢性疼痛的發(fā)展和維持。

Büyükaf?ar等［10］應(yīng)用熱板潛伏期和腹部收縮反射觀察小鼠行為的研究發(fā)現(xiàn)ROCK參與了傷害感受，ROCK抑制劑Y-27632可延長熱板潛伏期并減少疼痛刺激后腹部收縮發(fā)射，Western blot分析也證明了小鼠脊髓和腦組織中ROCK-2蛋白的表達。Boyce-Rustay等［11］在神經(jīng)病理性疼痛、骨關(guān)節(jié)炎性疼痛和炎性疼痛以及辣椒素誘導(dǎo)的急性痛和繼發(fā)性痛覺過敏的模型中評估了ROCK抑制劑Fasudil的鎮(zhèn)痛作用，發(fā)現(xiàn)Fasudil對神經(jīng)病理性疼痛和辣椒素誘導(dǎo)的疼痛療效顯著，對于炎性疼痛治療效果較弱，對骨關(guān)節(jié)痛和脊髓神經(jīng)結(jié)扎所導(dǎo)致疼痛的療效呈劑量依賴性。

RhoA/ROCK通路通過調(diào)節(jié)一氧化氮系統(tǒng)參與神經(jīng)病理性疼痛

一氧化氮(nitric oxide，NO)是周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)傷害性感受傳導(dǎo)中一個重要的信號分子。目前研究傾向于認為在脊髓水平低劑量和高劑量NO對傷害性感受的作用相反。鞘內(nèi)注射低劑量NO供體可對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛小鼠和長春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛小鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［12］，高濃度NO供體鞘內(nèi)注射則降低傷害性感受閾值［13］。

Ohsawa等［9］研究了RhoA/ROCK通路在糖尿病小鼠熱覺過敏中的作用。研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠脊髓中與細胞膜結(jié)合的RhoA(激活狀態(tài))表達增高;鞘內(nèi)注射RhoA抑制劑胞外酶C3(exoenzyme C3)及ROCK抑制劑Y-27632治療可緩解糖尿病小鼠的熱痛敏和機械痛敏;此外，腹腔注射辛伐他汀治療也緩解了糖尿病小鼠的疼痛，表明HMG-CoA還原酶抑制劑對熱痛敏的抑制主要通過RhoA/ROCK通路發(fā)揮作用。為了驗證辛伐他汀對熱痛敏的緩解是通過HMG-CoA還原酶途徑，Ohsawa等［9］在使用辛伐他汀的同時使用HMG-CoA還原酶的產(chǎn)物甲羥戊酸，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對熱痛敏的緩解作用被完全拮抗。進一步研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠脊髓中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和NO代謝物含量也有所下降，而辛伐他汀治療升高了脊髓中eNOS和NO代謝物含量，證明辛伐他汀對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的緩解作用主要是通過抑制RhoA活性從而增加eNOS和NO代謝物來實現(xiàn)。

RhoA/ROCK通路通過活化膠質(zhì)細胞參與神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)病理性疼痛具有神經(jīng)免疫功能障礙的許多特點，膠質(zhì)細胞可被傷害性刺激激活并在痛覺過敏的產(chǎn)生和持續(xù)中起到重要作用。激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性介質(zhì)和細胞因子的一個重要來源。應(yīng)用他汀類藥物被證明可以在神經(jīng)病理性疼痛模型中抑制機械和熱痛敏的發(fā)展，并可以明顯降低脊神經(jīng)損傷引起的脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化［14］。近年來有研究表明他汀類藥物主要通過抑制Rho蛋白的異戊二烯化，從而導(dǎo)致其功能性失活來發(fā)揮抗炎作用［15］。

Chen等［16］在福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛模型中研究辛伐他汀的鎮(zhèn)痛作用機制，發(fā)現(xiàn)大鼠鞘內(nèi)預(yù)注射辛伐他汀可明顯緩解福爾馬林引起的二相急性疼痛反應(yīng)，連續(xù)使用7 d還可抑制福爾馬林注射引起的長時程痛覺過敏。進一步研究發(fā)現(xiàn)脊髓小膠質(zhì)細胞活化和磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶可以被辛伐他汀明顯抑制。而外周福爾馬林注射可引起脊髓小膠質(zhì)細胞RhoA的明顯活化，其活化可被辛伐他汀所抑制。

RhoA/ROCK通路通過調(diào)節(jié)單胺能系統(tǒng)參與神經(jīng)病理性疼痛

在人類急性腦損傷的尸體解剖中發(fā)現(xiàn)腦部和脊髓的損傷可以分別誘導(dǎo)人類損傷部位表達RhoA、RhoB，在動物損傷模型中也可發(fā)現(xiàn)大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ的表達。研究表明腦部和脊髓的損傷可明顯激活RhoA/ROCK通路，且這一激活可持續(xù)很長時間，使得ROCK抑制劑對損傷后急性、亞急性甚至慢性病變都有明顯的治療意義。

既往研究認為下行單胺能的系統(tǒng)能緩解外周傷害性感受的傳導(dǎo)。鞘磷脂源性抑制物(myelin-associated glycoprotein and oligodendrocyte myelin glycoprotein，NogoA)通過與Nogo受體作用能妨礙軸突生長［17］，Nogo受體又可以與p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體相互作用來激活小GTP酶RhoA，RhoA的激活可以引起肌動蛋白去極化和生長錐塌陷［18-19］。Ramer等［20］研究發(fā)現(xiàn)抑制ROCK可在增強脊神經(jīng)背根切斷術(shù)后軸突重塑的同時緩解冷痛敏。應(yīng)用ROCK抑制劑Y-27632可加速去神經(jīng)傳入的脊髓背角中5-羥色胺能和酪氨酸羥化酶陽性軸突重塑，Y-27632的這種對單胺能神經(jīng)軸突的作用同樣能抑制脊髓背角傷害性刺激的傳導(dǎo)。其研究發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑對脊神經(jīng)背根切斷術(shù)后大鼠的熱痛閾和機械痛閾影響不顯著，而對冷痛閾有明顯提高。

RhoA/ROCK通路通過影響細胞骨架參與神經(jīng)病理性疼痛

ROCKs對細胞骨架的作用主要通過磷酸化其下游LIM激酶或肌球蛋白輕鏈激酶而實現(xiàn)，可影響細胞骨架移動性、細胞形態(tài)等［21-22］。神經(jīng)元的細胞骨架不僅保證細胞三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還為其對外界刺激的反應(yīng)提供重要的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。動態(tài)調(diào)節(jié)細胞骨架，尤其是肌動蛋白，可為細胞內(nèi)蛋白的移動構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。這一機制可使高爾基體將新合成的蛋白質(zhì)運輸至胞膜［23］。而絲切蛋白(cofilin)及其上游LIM結(jié)構(gòu)域蛋白激酶(LIM domain kinase，LIMK)被認為與某些蛋白從高爾基體釋放并運輸?shù)桨は嚓P(guān)［24］。Mittal等［25］發(fā)現(xiàn)當(dāng)delta阿片類受體與其激動劑結(jié)合后，可通過ROCK、LIMK和b-arr1激活絲切蛋白以調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合作用，從而使結(jié)合delta阿片類受體從高爾基體運輸至胞膜，以增強其結(jié)合delta阿片類受體的功能，而這一通路可被ROCK抑制劑所阻斷。

Yoshimi等［26］發(fā)現(xiàn)新型高選擇性ROCK抑制劑AS1892802對關(guān)節(jié)炎疼痛大鼠有鎮(zhèn)痛作用。AS1892802對炎性和非炎性疼痛都具有鎮(zhèn)痛作用。他們認為AS1892802的鎮(zhèn)痛作用與其對細胞骨架的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

Dina等［27］研究也發(fā)現(xiàn)給炎性疼痛大鼠皮內(nèi)注射一種肌動蛋白微絲解聚劑(latrunculin A)具有鎮(zhèn)痛效果，提示細胞骨架在痛覺信號的傳導(dǎo)過程中起到重要作用。Yoshimi等［26］發(fā)現(xiàn)AS1892802通過和微絲解聚劑(latrunculin A)相同的作用方式調(diào)節(jié)外周感覺神經(jīng)末梢細胞骨架的功能。

結(jié)語與展望

綜上，RhoA/ROCK信號通路在疼痛中起重要作用。近期多項研究都證明了小分子G蛋白在包括神經(jīng)病理性疼痛和痛覺過敏等多種疾病狀態(tài)中的活化。Qiu等［28］研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)松結(jié)扎模型大鼠神經(jīng)病理性疼痛與RhoA/LIMK/cofilin與通路激活相關(guān)，并且鞘內(nèi)注射辛伐他汀可抑制該通路的活化，緩解神經(jīng)病理性疼痛。Ohsawa等［29］認為RhoA/ROCK能引起星形膠質(zhì)細胞活化，進而使豆蔻?；槐彼岬鞍准っ窩底物蛋白(myristoylated alanine-rich C-kinase substrate，MARCKS)磷酸化，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛和痛覺過敏，辛伐他汀可通過抑制RhoA的活化，緩解痛覺過敏。RhoA/ROCK信號通路抑制劑在心血管、腫瘤等眾多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用［30-31］。因此，筆者認為抑制RhoA/ROCK信號通路在疼痛治療中具有重要前景。

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