厲 娜，黃志剛，梁 春，岳溫恒，吳宗貴

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

瓜蔞提取物治療鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

厲 娜，黃志剛，梁 春，岳溫恒，吳宗貴

目的 觀察瓜蔞提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌纖維化的治療作用。方法 采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠糖尿病模型，瓜蔞提取物選取瓜蔞皮注射液作為研究藥物，觀察正常對(duì)照組、鏈脲佐菌素(STZ)組、STZ+低劑量瓜蔞組和STZ+高劑量瓜蔞組小鼠體重、隨機(jī)血糖、心功能、左室心肌膠原容積分?jǐn)?shù)、左室心肌肥大細(xì)胞數(shù)目、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)變化。結(jié)果 STZ組小鼠體重下降、血糖升高、左室肥大細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目增加、左室膠原容積分?jǐn)?shù)增加，免疫組織化學(xué)染色顯示α-SMA和TGF-β1表達(dá)增加。治療組左室肥大細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目降低、左室膠原容積分?jǐn)?shù)減少，免疫組織化學(xué)染色顯示α-SMA和TGF-β1表達(dá)減少，瓜蔞高劑量組優(yōu)于低劑量組。結(jié)論 瓜蔞皮注射液可以改善STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠的心肌纖維化，可能機(jī)制為抑制肥大細(xì)胞在心肌組織中的浸潤(rùn)和激活。

糖尿病性心肌病；心肌纖維化；瓜蔞提取物；肥大細(xì)胞；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

2014年全球糖尿病病人已超過(guò)3.87億，僅2014年糖尿病病人死亡人數(shù)就達(dá)到490萬(wàn)人[1]。而在糖尿病病人死亡人群中，心血管疾病死亡占65%左右[2]。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病病人致殘和致死的主要原因之一，主要的病理改變是心肌組織纖維化?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為DCM主要的病機(jī)為痰濁、氣滯、血瘀引起的心脈受損、血瘀絡(luò)阻，瓜蔞為化痰類中藥的重要成分。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，觀察瓜蔞皮注射液對(duì)糖尿病心肌纖維化的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8周齡C57BL/6J小鼠，Ⅱ級(jí)，雄性，體重(22±2)g，購(gòu)自上海南方模式生物研究中心。

1.2 藥物和試劑 瓜蔞皮注射液(上海第一生化制藥廠，4 g/mL)，STZ(美國(guó)SIGMA-ALDRICH)，檸檬酸，檸檬酸二鈉，甲苯胺藍(lán)(美國(guó)AMRESCO公司)。

1.3 儀器 羅氏樂(lè)康全血糖儀、小動(dòng)物高分辨率超聲(Vevo770)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ (臨用前用0．1 mol/L、pH 4．5的檸檬酸緩沖液配成1%STZ溶液，過(guò)濾除菌)50 mg/kg，每天1次，連續(xù)5 d；連續(xù)2 d測(cè)量血糖≥250 mg/dL認(rèn)定為模型成功。

1.4.2 分組及給藥 24只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)(斷指法)，抽簽法隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、STZ組、STZ+低劑量瓜蔞組、STZ+高劑量瓜蔞組，每組6只。第1天～第5天為STZ誘導(dǎo)期，第6天～第19天為觀察期，其后10周為藥物干預(yù)期。低、高劑量瓜蔞組小鼠在藥物干預(yù)期分別給予腹腔注射瓜蔞皮注射液2 mL/(kg·d)或4 mL/(kg·d)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 體重、血糖和心功能的測(cè)定 每2周測(cè)小鼠體重1次。采取斷尾取血法測(cè)定小鼠隨機(jī)血糖。小鼠異氟烷吸入麻醉，調(diào)節(jié)吸入氣體的流量，控制心率在400次/min～500次/min，使用小動(dòng)物專用高頻超聲探頭選取心前區(qū)典型二維切面進(jìn)行圖像采集和數(shù)據(jù)分析。

1.5.2 組織病理學(xué)觀察 天狼猩紅染色計(jì)算左室膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)評(píng)價(jià)心肌纖維化程度，心肌免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)蛋白的表達(dá)，甲苯胺藍(lán)染色鑒別肥大細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 STZ腹腔注射誘導(dǎo)形成糖尿病小鼠模型 糖尿病組小鼠隨機(jī)血糖從STZ注射結(jié)束后第2天開(kāi)始升高，第12天達(dá)到峰值，并保持穩(wěn)定，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03，t=2.567)。詳見(jiàn)圖1。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 瓜蔞皮注射液對(duì)小鼠體重和血糖的影響 正常對(duì)照組體重?zé)o明顯改變，其他各組小鼠的體重進(jìn)行性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，瓜蔞皮注射液對(duì)體重?zé)o影響。各模型組小鼠的血糖明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。兩個(gè)劑量瓜蔞組血糖低于STZ組(P<0.05)。STZ+高劑量瓜蔞組血糖低于STZ+低劑量瓜蔞組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明瓜蔞皮注射液可輕度降低小鼠血糖。

2.3 瓜蔞皮注射液對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠心功能的影響 心臟超聲結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、STZ組、STZ+高劑量瓜蔞組小鼠左室結(jié)構(gòu)和收縮功能各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 瓜蔞皮注射液對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌纖維化的影響 正常對(duì)照組、STZ組、STZ+低劑量瓜蔞組和STZ+高劑量瓜蔞組左室CVF分別為(1.40±0.35)%、(9.06±0.81)%、(6.26±0.11)%、(4.82±0.91)%；α-SMA免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)OD值分別為3027.43±938.13、17081.65±1360.72、9853.07±824.51、5 974.71±927.67，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；TGF-β1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與α-SMA一致，IOD值分別為9927.72±1673.18、66495.50±2 386.65、51 217.57±3 769.32、19 982.48±1 426.54，其他各組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。說(shuō)明瓜蔞皮注射液對(duì)糖尿病心肌纖維化有預(yù)防和治療作用。詳見(jiàn)圖2～圖4。

注： 與正常對(duì)照組比較，***P<0.001；與STZ組比較，*P<0.05，#P<0.001。

1組小鼠心肌纖維化程度(400×)

注：A代表正常對(duì)照組；B代表STZ組；C代表STZ+高劑量瓜蔞組。與正常對(duì)照組比較，* P<0.05，***P<0.001；與STZ組比較，#P<0.001；與STZ+低劑量瓜蔞組比較，△P<0.001。

圖3 免疫組織化學(xué)染色觀察心室肌α-SMA的表達(dá)(400×)

注：A代表正常對(duì)照組；B代表STZ組；C代表高劑量瓜蔞組。與正常對(duì)照組比較， ***P<0.001；與STZ組比較，*P<0.001；與STZ+低劑量瓜蔞組比較，△P<0.001。

圖4 免疫組織化學(xué)染色觀察心室肌TGF-β1的表達(dá)(400×)

2.5 瓜蔞皮注射液對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌肥大細(xì)胞數(shù)目的影響 心肌組織中肥大細(xì)胞多分部在心外膜下和血管周圍。正常對(duì)照組小鼠心肌中肥大細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞體積較小，顆粒含量少。其他各組肥大細(xì)胞數(shù)目明顯增加，體積較大，顆粒含量多，但應(yīng)用瓜蔞治療后，肥大細(xì)胞數(shù)目較STZ組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6。

注：圖中黑色箭頭所指為心肌肥大細(xì)胞；與正常對(duì)照組比較，

***P<0.001；與STZ組比較，* P<0.05，#P<0.001。

圖5 甲苯胺藍(lán)染色顯示心肌組織肥大細(xì)胞(400×)

3 討 論

目前研究認(rèn)為多次小劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型是1型糖尿病模型[3]。本研究中C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ，血糖升高且保持穩(wěn)定，可以成功誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型。該結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。糖尿病小鼠成模12周心臟超聲結(jié)果與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而有研究結(jié)果顯示左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室壁厚度降低[2-4]。出現(xiàn)這種差異的可能原因有：本研究觀察的時(shí)間尚短；再者應(yīng)進(jìn)一步測(cè)量舒張功能相關(guān)的指標(biāo)，如E’/A'、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)等，因?yàn)樘悄虿⌒孕募〔〉脑缙诓±砩砀淖優(yōu)樽笫沂鎻埞δ艿臏p退。

心肌纖維化是發(fā)生DCM的重要病理機(jī)制[5]。心肌纖維化導(dǎo)致左室壁僵硬且順應(yīng)性降低，導(dǎo)致收縮和舒張功能障礙[6]。本研究結(jié)果顯示，STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠在成模12周時(shí)心肌組織纖維化明顯，具體表現(xiàn)在TGF-β等促進(jìn)纖維化的指標(biāo)明顯升高，α-SMA蛋白表達(dá)增加，提示由成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化增加，天狼猩紅染色確定心肌組織膠原沉積。該結(jié)果與現(xiàn)有結(jié)果一致[4，7]。

DCM在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于消渴、心悸和胸痹范疇。瓜蔞皮是祛痰之要藥，具有寬胸、理氣、散結(jié)、化痰之功效。史國(guó)玉等[8]分析瓜蔞皮藥材的HPLC指紋圖譜，確認(rèn)的成分有香草酸、異槲皮苷、香草酸葡萄糖苷、蘆丁和柯伊利素葡糖糖苷?，F(xiàn)有研究顯示其能抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，具有抗纖維化的作用[9]。本研究選用瓜蔞皮注射液為研究藥物，結(jié)果顯示其對(duì)糖尿病小鼠的體重?zé)o改變，可輕度降低血糖，降低心肌肥大細(xì)胞數(shù)目，使α-SMA和TNF-β1的蛋白表達(dá)下降，CVF降低。結(jié)果顯示其可以抑制肥大細(xì)胞的激活、抑制糖尿病心肌纖維化。其他研究也證實(shí)以瓜蔞為主要成分的瓜蔞薤白半夏湯能降低肺組織TNF-β1的表達(dá)，減輕平陽(yáng)霉素所致的大鼠肺纖維化[10]。

肥大細(xì)胞廣泛參與急性心肌梗死、高血壓、動(dòng)靜脈漏等病理情況下的心臟重構(gòu)和心肌纖維化，并在其中起到關(guān)鍵作用[11]。既往的研究顯示，應(yīng)用肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑可以明顯的改善糖尿病心肌纖維化[12]。在本研究中，糖尿病組小鼠心肌肥大細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目明顯增加，應(yīng)用瓜蔞皮注射液后肥大細(xì)胞數(shù)目降低。瓜蔞皮注射液改善糖尿病心肌纖維化的可能機(jī)制為抑制肥大細(xì)胞在心肌組織中的浸潤(rùn)和激活。

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(本文編輯郭懷印)

Therapeutic Effect of Trichosanthes Fruit Extract on Myocardial Fibrosis in Streptozotocin Induced Diabetic Mice

Li Na，Huang Zhigang，Liang Chun，Yue Wenheng，Wu Zonggui

Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China Corresponding Author：Wu Zonggui

Objective To observe the therapeutic effect of extract of trichosanthes fruit extract(TFE) on myocardial fibrosis in streptozotocin(STZ) induced diabetic mice.Methods Diabetic model was induced by STZ in C57BL / 6J mice.Gualoupi injection was used as the study drug.The mice were randomly assigned to normal control group，STZ group，STZ + low dose TFE group，and STZ + high dose TFE group.Body weight，random blood glucose，cardiac function，left ventricular collagen volume fraction，mast cell number inmyocardium were observed.The expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)and transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1) in myocardium were tested by immunohistochemical staining.Results Mice in STZ group showed declined body weight，hyperglycemia，more mast cell infiltration in myocardium，increased left ventricular collagen volume fraction and elevated expression of α-SMA and TGF-beta 1.Mice in treating group had less mast cell infiltration，lower left ventricular collagen volume fraction and reduced expression of α-SMA and TGF-beta 1.Results in high dose TFE group was better than that in low dose TFE group.Conclusion Gualoupi injection can improve cardiac fibrosis in STZ induced diabetic mice.The possibly mechanism is inhibiting the infiltration and activation of mast cells in myocardial tissue.

diabetic cardiomyopathy；myocardial fibrosis；trichosanthes fruit extract；mast cells；α-smooth muscle actin；transforming growth factor beta 1

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81473445)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(No.81303111)

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院(上海 200003)

吳宗貴，E-mail：zgwu@medmail.com

R587.1 R255.4

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．006

1672-1349(2016)04-0355-03

2015-10-11)