王麗娟

（遼寧職業(yè)學(xué)院，遼寧　鐵嶺112099）

雞新城疫血凝和血凝抑制試驗操作注意事項

王麗娟

（遼寧職業(yè)學(xué)院，遼寧鐵嶺112099）

雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗結(jié)果常常因為操作不規(guī)范、使用標(biāo)準(zhǔn)不準(zhǔn)確等人為主觀因素的影響，導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至失敗。本文著重對雞新城疫HA與HI試驗血樣的采集和處理、器材的選擇、試劑配制、HA試驗、HI試驗等操作中的注意事項作以簡要闡述，以供參考。

新城疫；HA試驗；HI試驗；注意事項；雞

雞新城疫是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，給養(yǎng)禽生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。HA和HI試驗是診斷雞新城疫、檢測雞群免疫抗體水平、免疫效果和確定免疫時機(jī)最常用的實驗室檢驗方法。該試驗方法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、實用經(jīng)濟(jì)和對抗體水平進(jìn)行量化的優(yōu)點，能夠處理大量的樣品，在基層臨床實踐中被廣泛應(yīng)用。但試驗結(jié)果常常因為操作不規(guī)范、使用標(biāo)準(zhǔn)不準(zhǔn)確、試驗材料不標(biāo)準(zhǔn)等人為主觀因素影響很大，導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至失敗。因此做試驗前必須掌握操作要領(lǐng)和注意事項，精心操作，提高試驗的準(zhǔn)確性。

1　血樣的采集和處理

1.1樣品采集采血者要做好自身防護(hù)工作，做到無菌采樣。采血部位一般以翅靜脈為主，雛雞多用心臟采血。采血量為0.5～1mL。取血要緩慢平穩(wěn)，避免靜脈塌陷或出現(xiàn)血泡。取樣后將采血器的活塞向后拉一小段，針筒內(nèi)留出部分空間，并將采血器稍傾斜放置，以便血液和空氣充分接觸。為減少脂血，可在動物進(jìn)食前采集血樣。

1.2樣品處理血樣在運輸過程中不可劇烈振蕩和搖晃，以免溶血。室溫在25℃以上時全血容易凝固，靜置2～4h即可析出血清。若氣溫過低可放入37℃溫箱中孵育2～3h或血液完全凝固后3000r/min離心2～5min，即可獲得血清樣品，將析出的血清移至小塑料離心管中及時冷藏備用。有溶血、膠胨樣現(xiàn)象的血清樣品應(yīng)棄去。

1.3樣品貯存血清樣品要及時檢測，4℃冰箱中冷藏可保存5d，長時間保存可置-20℃環(huán)境下冷凍，檢測前應(yīng)緩慢溶化并充分混勻，避免反復(fù)凍融。

2　器材的選擇

2.1血凝反應(yīng)板選擇一次性使用96孔90°的V型血凝反應(yīng)板，應(yīng)選擇質(zhì)量好、孔面規(guī)整及V型內(nèi)孔面潔凈光滑的反應(yīng)板，板面有彎曲甚至折痕的反應(yīng)板要及時剔除，若不加選擇，則會影響紅細(xì)胞凝集和結(jié)果判定。整包開封后，若一次使用不完，應(yīng)保持包裝盡量完整，確保剩余反應(yīng)板的清潔無磨損。

2.2移液器主要有單道、多道可調(diào)微量移液器，應(yīng)選擇合適的量程，以便精確度的提高。吸頭在裝配時，切勿用移液器反復(fù)上下撞擊吸頭來上緊。吸液時用大拇指先按到第一檔，再將吸頭尖端垂直浸入液面3mm以下，緩慢釋放按鈕，待液體進(jìn)入吸嘴。放液時將移液器稍傾斜，吸頭對準(zhǔn)板孔，先按到第一檔，打出大部分液體，再按到第二檔，將剩余的液體全部排出。應(yīng)做到“慢吸快打”，保證加入液體的體積一致。加樣完畢，把移液器的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)，定期進(jìn)行校正或鑒定，避免產(chǎn)生錯誤或不精確的結(jié)果。

2.3吸頭應(yīng)選擇與移液器相匹配的一次性吸頭，要求吸頭內(nèi)清潔無菌，吸頭表面光潔平滑，防止液體滯留外壁或吸頭內(nèi)堵塞引起誤差。

3　試劑配制

3.1稀釋液依據(jù)《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T16550-2008）國家標(biāo)準(zhǔn)，HA和HI試驗的稀釋液為0.01mol/LpH7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）。最好現(xiàn)配現(xiàn)用，高壓滅菌后使用。稀釋液的pH值控制在7.0～7.2。pH值在5.8以下紅細(xì)胞易發(fā)生溶血或自凝；pH值在7.8以上，吸附于紅細(xì)胞上的病毒易脫落，凝集圖像容易消失，對照有可能不成立。

在實際生產(chǎn)中，也可采用滅菌的生理鹽水做稀釋液，pH值應(yīng)保持在7.0，如有偏差，可用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)。用生理鹽水比PBS稀釋液測出的抗體效價要低1個值。

3.21%雞紅細(xì)胞（RBC）懸液為避免雞只個體的紅細(xì)胞差異，應(yīng)采集至少3只SPF公雞或健康無新城疫和禽流感抗體的非免疫成年公雞的血液。采血之前在一次性注射器中先吸入抗凝劑，再采血。采血完畢，迅速顛倒混勻，防止血凝和溶血，要拔下針頭，貼管壁緩慢注入已事先加入3～4倍體積的PBS的離心管中，混勻，以2000r/min離心5～10min，先吸棄紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜和血漿，再吸棄上清液；向沉淀的紅細(xì)胞再加PBS，緩慢混勻，重復(fù)以上步驟，反復(fù)離心洗滌3～5次，直至洗凈血漿和白細(xì)胞為止。一定吸取底部壓積紅細(xì)胞放入已事先加入PBS的容器中，混勻配成體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液，短期于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.3工作試劑主要有病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽性血清和陰性血清。凍干的試劑應(yīng)按照說明中規(guī)定的體積用0.01mol/LpH 7.2PBS稀釋液溶解，最好用滅菌注射用水或純水。為避免反復(fù)凍融和細(xì)菌污染，應(yīng)根據(jù)每次使用的量，以無菌操作將溶解試劑分裝成小包裝后置于-20℃冷凍保存，分批使用。

4　HA和HI試驗

4.1工作抗原每次試驗前必須檢測抗原的血凝效價，以確定4個血凝單位（HAU）工作抗原的配制。為避免誤差，最好同時進(jìn)行3排病毒抗原的測定，判定結(jié)果時取平均值作為血凝終點滴度。4HAU抗原在HI試驗前需做回歸試驗驗證，現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫下不可久存，且不可反復(fù)凍融。如檢驗樣品過多，最好放在冰上，以免抗原失效。

4.2加樣加稀釋液時，應(yīng)加在板孔的底部?？乖⒀鍢悠吩诩尤胫耙靹?，保證加樣的均一性。4HAU抗原和1%紅細(xì)胞懸液在使用時要邊加邊搖勻，保證每孔所加的樣品量和濃度準(zhǔn)確一致，并且應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，要避免移液器吸頭與孔內(nèi)的液體接觸，應(yīng)從后往前加，先對照、再高稀釋倍數(shù)、最后低稀釋倍數(shù)順序懸滴加入，減少交叉污染，從而增加了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.3倍比稀釋抗原或血清移液器稍傾斜一定角度，使用第一檔稀釋液體，應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸5～7次，且每孔吹吸次數(shù)要一致，滴頭不要離開液面，防止產(chǎn)生氣泡，以便混合均勻。

4.4溫度控制4℃以下紅細(xì)胞易發(fā)生自凝；在37℃時，凝集的紅細(xì)胞易從病毒中解脫，使凝集現(xiàn)象消失。故試驗環(huán)境溫度應(yīng)控制在20℃～25℃室溫。

4.5時間控制新城疫病毒表面不僅具有血凝素（HA），還具有神經(jīng)氨酸酶（NA），可破壞病毒的血凝性，使病毒從吸附的紅細(xì)胞解脫，時間過長，紅細(xì)胞從病毒表面脫落造成錯判，所以靜置孵育時間應(yīng)嚴(yán)格控制。應(yīng)不時觀察，在PBS對照孔的紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底時判定結(jié)果較好，大約在20～40min左右，時間過早或過晚都會影響試驗結(jié)果的判定。

4.6對照試驗每次試驗必須設(shè)定適當(dāng)?shù)年栃匝?、陰性血清（稀釋方法同被檢血清）和抗原對照，盡量每個反應(yīng)板都要設(shè)置陰陽性對照，以驗證試驗是否成立。只有陰性血清的HI效價不大于2log2，陽性血清的HI效價不超過標(biāo)準(zhǔn)值的±1個滴度，HI試驗結(jié)果判定才有效。

4.7HA和HI試驗的結(jié)果判定在PBS對照孔結(jié)果正確的情況下，將血凝板傾斜，從背側(cè)觀察，對照孔的紅細(xì)胞應(yīng)沿傾斜面完全呈淚珠狀流淌。以紅細(xì)胞完全不流淌的一孔作為該抗原的血凝效價，為1HAU；參照對照孔，與PBS對照孔中的紅細(xì)胞淚滴大小、流速一致的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清的血凝抑制（HI）效價。若4HAU抗原對照孔沒有完全凝集，生理鹽水對照孔沒有完全沉淀，此反應(yīng)板試驗失敗，樣品要重新檢測。

4.8稀釋度的選擇HA效價高于11log2和HI效價高于10log2時可繼續(xù)增加稀釋度。

綜上所述，雞新城疫HA和HI試驗結(jié)果準(zhǔn)確與否，與試驗各個影響因素的綜合作用密切相關(guān)。因此，要嚴(yán)格按照操作規(guī)程認(rèn)真細(xì)致的進(jìn)行操作，并在一些操作技巧和熟練程度上苦下功，盡量消除不利因素，減少誤差，保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.06.016

王麗娟（1967～），學(xué)士，副教授，從事獸醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)研究