陳麗君， 劉明騫， 廖柏勇， 李俊成， 陳曉陽(yáng)

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 試驗(yàn)中心, 廣東 廣州 510642；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 華南農(nóng)業(yè)博物館籌建辦公室， 廣東 廣州 510642；3 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

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苦楝SRAP分子標(biāo)記及遺傳多樣性分析

陳麗君1， 劉明騫2， 廖柏勇3， 李俊成3， 陳曉陽(yáng)3

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 試驗(yàn)中心, 廣東 廣州 510642；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 華南農(nóng)業(yè)博物館籌建辦公室， 廣東 廣州 510642；3 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】為快速分析苦楝Meliaazedarach不同種源提供方法，揭示苦楝遺傳多樣性，為苦楝的開(kāi)發(fā)、利用及選擇育種提供一定的理論依據(jù)。【方法】從783對(duì)SRAP引物組合中篩選出20對(duì)多態(tài)性較高的引物組合，對(duì)苦楝國(guó)內(nèi)全分布區(qū)的37個(gè)種源和肯尼亞1個(gè)種源樣品進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析。【結(jié)果】20對(duì)引物組合共擴(kuò)增出242條譜帶，其中多態(tài)性條帶101條，多態(tài)性百分率平均值為40.89%，每對(duì)引物組合擴(kuò)增條帶5～17條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶12.1條；其多態(tài)性信息量(Polymorphism information content，PIC)值介于0.188～0.488，平均值為0.299?；赨PGMA法聚類(lèi)以0.350為閾值可將38個(gè)苦楝種源劃分為7類(lèi)，在此基礎(chǔ)上，去掉2個(gè)種源，將其余36個(gè)種源劃分5個(gè)地理類(lèi)群?！窘Y(jié)論】SRAP分子標(biāo)記可以很好地反映苦楝的遺傳多樣性，聚類(lèi)類(lèi)群劃分結(jié)果有明顯的地理趨勢(shì)和氣候生態(tài)特征。

關(guān)鍵詞：苦楝； 種源； 遺傳多樣性； SRAP

苦楝Meliaazedarach又名翠樹(shù)、楝樹(shù)、紫花樹(shù)、森樹(shù)等，為楝科楝屬落葉喬木，分布于中國(guó)、韓國(guó)、日本、印度、斯里蘭卡、印度尼西亞和澳大利亞等地，歐洲、美洲也有栽培[1]?？嚅L(zhǎng)速度快、木材材質(zhì)優(yōu)良、紋理美麗，易加工，可用于家具、建筑、農(nóng)具、船舶、樂(lè)器等方面，木材抗白蟻、抗蟲(chóng)蛀、耐腐?？嚅蜔焿m、能大量吸收有毒有害氣體，是優(yōu)良的城市及工礦區(qū)綠化樹(shù)種，也是我國(guó)南方四旁綠化常用樹(shù)種[2-3]?？嚅母?、皮、花、果均可入藥，也可作為植物源農(nóng)藥[4]。分子標(biāo)記是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記之后最為可靠的遺傳標(biāo)記技術(shù)[5～6]。目前已有少量文獻(xiàn)對(duì)部分苦楝種源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，程詩(shī)明[7]采用7對(duì)AFLP引物對(duì)分層隨機(jī)抽樣的8個(gè)群體240個(gè)個(gè)體基因組進(jìn)行研究分析，共擴(kuò)增得到658條清晰譜帶，其中650條為多態(tài)性譜帶，各群體多態(tài)位點(diǎn)百分率為51.4%～76.29%；陳羨德[8]利用篩選出的20個(gè)RAPD引物對(duì)15個(gè)不同來(lái)源的苦楝進(jìn)行分析，20個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出193條重復(fù)性好、清晰的譜帶，其中多態(tài)性譜帶共計(jì)189條，占97.9%。夏海濤[9]采用篩選出的24個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列間多態(tài)性(Inter-simple sequence repeat，ISSR)引物對(duì)13個(gè)種源苦楝優(yōu)樹(shù)DNA進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出382個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為98.43%，其中南寧和倉(cāng)山種源的多態(tài)位點(diǎn)百分率最高，為54.97%，延平的多態(tài)位點(diǎn)百分率最低，為43.98%，說(shuō)明13個(gè)種源苦楝的遺傳多樣性豐富。但是，苦楝分布廣泛，以前的研究采樣點(diǎn)偏少，不足以準(zhǔn)確地反映全分布區(qū)苦楝的遺傳多樣性。本項(xiàng)研究從國(guó)內(nèi)18個(gè)省(區(qū)、市)37個(gè)縣(市)采集苦楝種子，并收集肯尼亞內(nèi)羅畢苦楝種子，采取相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子標(biāo)記方法進(jìn)行遺傳多樣性分析。此外，SRAP分子標(biāo)記結(jié)合了擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)及隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)各自的優(yōu)點(diǎn)，方便快速，只需要極少量DNA材料，且不需要預(yù)先知道DNA序列信息，即可快速獲得大量的信息，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，且再現(xiàn)性較高，重復(fù)性較好[10～11]。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以國(guó)內(nèi)全分布區(qū)的37個(gè)種源和肯尼亞內(nèi)羅畢1個(gè)種源為對(duì)象進(jìn)行苦楝SRAP遺傳多樣性分析，采種點(diǎn)地理位置及編號(hào)見(jiàn)表1。試驗(yàn)材料采于廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃1年生苦楝，采集幼嫩枝條上嫩葉6～8片，低溫保存用于提取DNA。

1.2試驗(yàn)儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器主要有超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo nanodrop 2000)，PCR擴(kuò)增儀(PTC-200)，DYY-Ⅲ型恒壓恒流電泳儀(北京六一儀器公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)，高速離心機(jī)(Eppendorf)等。試驗(yàn)用TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+及100 bp DNA ladder 等購(gòu)自TaKaRa公司，瓊脂糖和Gold View核酸染料購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物科技有限公司，酚、三氯甲烷、乙醇、異丙醇、硫代硫酸鈉、硼酸、甲醛、冰醋酸、硝酸銀等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成，本研究所用引物序列見(jiàn)表2。

表1　苦楝材料及來(lái)源

表2　用于苦楝SRAP分析的引物序列

1.3苦楝DNA提取和SRAP-PCR擴(kuò)增

苦楝基因組 DNA 提取參照上海生工生物工程有限公司柱式基因組 DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。所提取的基因組DNA用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)單因子及正交試驗(yàn)建立并優(yōu)化苦楝SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為模板DNA 30 ng、dNTPs濃度0.125 mmol·L-1、Mg2+濃度2.25 mmol·L-1、引物濃度0.48 μmol·L-1、TaqDNA聚合酶0.75 U(25 μL)。SRAP-PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)將具有相同遷移率的擴(kuò)增片段，按0/1系統(tǒng)紀(jì)錄，有帶記為1，無(wú)帶記為0，并參照標(biāo)準(zhǔn)Marker帶估計(jì)擴(kuò)增片段的大小，形成0/1矩陣。將圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料，并輸入Excel 2007中建立0/1數(shù)據(jù)矩陣，使用NTSYS-pc2.10e軟件計(jì)算遺傳距離和相似系數(shù)，使用非加權(quán)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2結(jié)果與分析

2.1SRAP擴(kuò)增多態(tài)性條帶統(tǒng)計(jì)

本研究采用20對(duì)SRAP引物對(duì)苦楝38個(gè)不同種源進(jìn)行擴(kuò)增，分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，引物擴(kuò)增條帶多數(shù)集中在100～1 500 bp之間，20對(duì)引物組合對(duì)全部樣品進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出247條帶，其中多態(tài)性條帶101條，平均多態(tài)性百分率為40.89%。20對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)從5條(Me11/Em29)到17條(Me20/Em7)不等，平均為12.1條。多態(tài)性條帶的數(shù)量從1條(Me11/Em29、Me6/Em29)到12條(Me20/Em7)不等，多態(tài)性比率最高的引物組合為Me24/Em14(88.89%)，其次為Me20/Em7(70.59%)、Me1/Em9(60.00%)；多態(tài)性比率最低的引物組合為Me6/Em29(12.50%)，總體而言，引物多態(tài)性比率較高。

多態(tài)性信息量(Polymorphism information content，PIC)是用來(lái)衡量不同引物對(duì)反應(yīng)多態(tài)性高低的程度，20對(duì)引物組合的PIC為0.188～0.488，其中Me1/Em9擴(kuò)增引物總條帶數(shù)(15條)、多態(tài)性條帶數(shù)(9條)以及PIC(0.387)均較高，該引物組合可以成為苦楝SRAP分子標(biāo)記的骨干引物[12]，20對(duì)引物的平均PIC為0.299，介于0.25～0.50之間，說(shuō)明所選的SRAP引物可以很好地反映苦楝的遺傳多樣性[13]。引物Me1/Em9的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖1。

2.238個(gè)不同苦楝種源的聚類(lèi)分析

根據(jù)SRAP標(biāo)記分析結(jié)果，對(duì)苦楝38個(gè)種源間基于Nei’s的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，從聚類(lèi)分析結(jié)果(圖2)可知，以0.350為閾值，38個(gè)種源可以分為7類(lèi)，A04、A09、B01、B04、B06、C02、C03、C10、H03、H06、Z01為第1類(lèi)，這一類(lèi)主要分布在海南、廣東、廣西等地理位置偏南的地區(qū)，其中肯尼亞內(nèi)羅畢的種源Z01也在這一類(lèi)；B03、E02、E03、F01、F04、I01、J01、J02、K02為第2類(lèi)，這一類(lèi)主要分布在廣東、福建、浙江、江蘇東部沿海省份；E01、G01、G03、I02、J03、K01、L01、M02、P03、P04、U01為第3類(lèi)，主要分布在湖南、湖北、陜西、河北等地；D01、D05、M01為第4類(lèi)，主要為云南種源；Q01、Q02為第5類(lèi)，來(lái)自甘肅。O01和C04各為一類(lèi)，分別來(lái)自河南內(nèi)鄉(xiāng)和廣西永福。

表3　SRAP引物組合擴(kuò)增信息分析

M：100 bp DNA ladder；1～38分別為種源編號(hào)A04、A09、B01、B03、B04、B06、C02、C03、C04、C10、D01、D05、E01、E02、E03、F01、F04、G01、G03、H03、H06 、I01、I02、J01、J02、J03、K01、K02、L01、M01、M02、O01、P03、P04、Q01、Q02、U01、Z01的DNA。

圖1Me1/Em9引物對(duì)苦楝群體材料的擴(kuò)增聚丙烯電泳圖

Fig.1Amplified products of samples from different provenances of Melia azedarach on polyacrylamide gels with the primer combination of Me1/Em9

圖2　SRAP標(biāo)記的38個(gè)苦楝種源UPGMA聚類(lèi)圖

3討論

本試驗(yàn)從783對(duì)引物組合中篩選獲得多態(tài)性較好的引物組合20對(duì)，這些引物組合多態(tài)性百分率平均為40.89%，PIC平均為0.299，說(shuō)明SRAP分子標(biāo)記可以較好地應(yīng)用于苦楝的遺傳多樣性分析[13]，并為充分開(kāi)發(fā)、利用苦楝資源及完善苦楝遺傳背景分析奠定基礎(chǔ)。通過(guò)本試驗(yàn)開(kāi)發(fā)出了多態(tài)性比率和PIC均較高的可用于苦楝SRAP分析的骨干引物(Me4/Em5、Me1/Em9)，可將大部分種源劃分為準(zhǔn)確的類(lèi)型，為快速分析苦楝不同種源提供了方法。

根據(jù)SRAP標(biāo)記分析結(jié)果，以0.350為閾值，可將38個(gè)苦楝種源劃分為7類(lèi)。其中，O01和C04各為一類(lèi)，分別來(lái)自河南內(nèi)鄉(xiāng)和廣西永福。由于這2類(lèi)僅各含1個(gè)種源，代表性不強(qiáng)，為穩(wěn)妥起見(jiàn)，河南內(nèi)鄉(xiāng)和廣西永福暫不獨(dú)立成類(lèi)，將其余的36個(gè)種源，劃分5個(gè)類(lèi)群?？嚅N源類(lèi)群劃分有明顯的地理趨勢(shì)和氣候生態(tài)特征。例如第1類(lèi)群的種源來(lái)自海南、廣東、廣西等偏南省份，屬于緯度較低，沿海地區(qū)的苦楝，這些地方水熱條件充足。肯尼亞內(nèi)羅畢種源聚在此類(lèi)，這可能因?yàn)楫?dāng)?shù)貧夂驐l件與我國(guó)兩廣、海南島的氣候更相似；第2類(lèi)群種源主要分布在廣東、福建、浙江、江蘇東部沿海省份，其氣溫和降水量普遍低于第1類(lèi)種源地；第3類(lèi)群種源主要分布在湖南、湖北、陜西、河北等地，其氣溫和降水量低于第2類(lèi)種源地；第4、5類(lèi)群分別為云南、甘肅種源，兩地區(qū)的氣候差異很大，與前3類(lèi)也有較大差異。

將該聚類(lèi)結(jié)果與苦楝果核及種子性狀做比對(duì)[14]，果實(shí)主要表型特征為第1類(lèi)的果實(shí)種子形態(tài)較小且質(zhì)量較輕、棱粒較小；第2類(lèi)的果實(shí)果核棱紋明顯、果核單果棱數(shù)及粒數(shù)較少；第3類(lèi)的果實(shí)種子較寬，果核形態(tài)近球形且棱紋不明顯；第4類(lèi)的果實(shí)種子形狀較大且質(zhì)量較重，果核皮較厚，果核單果棱數(shù)較多，但種粒數(shù)較少；第5類(lèi)的果實(shí)果核和種子的質(zhì)量及形態(tài)較大，核果皮較厚且棱紋較明顯，果核單果棱數(shù)及粒數(shù)較多。

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【責(zé)任編輯柴焰】

Analysis of genetic diversity of Melia azedarach with SRAP markers

CHEN Lijun1, LIU Mingqian2, LIAO Boyong3, LI Juncheng3, CHEN Xiaoyang3

(1 Center for Teaching & Research Base, South China Agricultural University， Guangzhou 510642, China；

2 Preparation Office of South China Agricultural Museum, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;

3 Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm/College of

Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To set up a method for rapid detection of different provenances, to investigate the genetic diversity, and to provide a theoretical basis for development, utilization and selective breeding ofMeliaazedarach.【Method】 Twenty SRAP primer combinations (PCs) with relatively high polymorphisms from 783 PCs were selected to analyze the genetic diversity of 37 provenances from all distribution areas nationwide and 1 provenance from Kenya. 【Result】The results showed 242 clear bands were amplified by 20 PCs, among which 101 bands (40.89%) were polymorphic. The number of bands of each PC ranged from 5 to 17, with an average of 12.1. The polymorphism information content (PIC) values of these PCs ranged from 0.188 to 0.488, with an average of 0.299. Thirty-eight provenances could be divided into 7 categories based on UPGMA (with a threshold value of 0.350), and furthermore, by excluding 2 provenances, the rest 36 provenances could be divided into 5 geographic groups. 【Conclusion】SRAP markers can be used to effectively evaluate the genetic diversity ofMeliaazedarach, and the results of cluster analysis demonstrate clear geographical trends and climatic-ecological characteristics.

Key words：Meliaazedarach; provenance; genetic diversity; SRAP

中圖分類(lèi)號(hào)：S792.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-411X(2016)01-0070-05

基金項(xiàng)目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2011KJCX002)

作者簡(jiǎn)介：陳麗君(1989—)，女，碩士， E-mail：chenlijun0311@163.com；通信作者：陳曉陽(yáng)(1958—)，男，教授，博士，E-mail：xychen@scau.edu.cn

收稿日期：2015-03-13優(yōu)先出版時(shí)間：2015-12-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1133.026.html

陳麗君， 劉明騫， 廖柏勇，等.苦楝SRAP分子標(biāo)記及遺傳多樣性分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(1):70-74.