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(解放軍第97醫(yī)院中心實驗室，徐州221004)

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2-脫氧葡萄糖對體外培養(yǎng)人γδT細胞CCR5表達及殺傷功能影響①

鄭璐陳永強②劉軍權(quán)呂小婷張娟孫蕾清徐晶周忠海陳復興

(解放軍第97醫(yī)院中心實驗室，徐州221004)

陳復興(1953年-)，男，主任技師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:chenfuxingTITC@163.com。

[摘要]目的：觀察糖基化抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)對γδT細胞增殖、趨化因子受體CCR5和殺傷功能的影響。方法：從健康人外周血中分離單個核細胞，加入到γδT細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得γδT細胞。用不同濃度的2-DG誘導培養(yǎng)γδT細胞48 h后，用CCK-8法測定不同濃度2-DG組的γδT細胞增殖和殺傷能力；用流式細胞術(shù)檢測γδT細胞CCR5的表達和殺傷功能指標的影響。結(jié)果：培養(yǎng)10 d后的γδT細胞純度達到(88.18±3.41)%。2-DG濃度在0~1.0 mmol/L時對γδT細胞的增殖影響不明顯，而當濃度大于1.0 mmol/L后能顯著抑制γδT細胞的增殖。2-DG濃度在0~2.0 mmol/L范圍內(nèi)能促進CCR5的表達，且在0.5和1.0 mmol/L時能促進殺傷指標CD107a和穿孔素的表達及對結(jié)腸癌HCT116細胞的殺傷能力。結(jié)論：2-DG能促進γδT細胞表面趨化因子受體CCR5的表達，且在一定濃度范圍內(nèi)能提高γδT細胞的體外殺傷功能。

γδT細胞是近年來研究較多的抗腫瘤免疫效應(yīng)細胞之一，它主要分布于黏膜和上皮組織內(nèi)，外周血中僅占單個核淋巴細胞0.5%~5%。γδT細胞具有較強的抗腫瘤作用，以組織相容性復合物(Major histocompatibility complex,MHC) 非限制性方式識別腫瘤抗原從而發(fā)揮殺傷作用，受腫瘤主要免疫逃逸機制影響較小[1]。體外常規(guī)擴增的γδT細胞已經(jīng)用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效[2,3]。為了提高γδT細胞治療腫瘤效果，需要獲得足夠數(shù)量并能使回輸?shù)襟w內(nèi)后能迅速有效的遷移到腫瘤局部發(fā)揮抗腫瘤作用。

2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)為葡萄糖類似物，具有抗腫瘤、抗病毒和細菌感染及延緩衰老等作用[4]。最近Sukumar等研究發(fā)現(xiàn)2-DG抑制糖代謝獲得在體內(nèi)能快速分布并長久存活和較強抗腫瘤活性的記憶CD8+T細胞[5]。而CCR5為趨化因子 CC 受體家族成員，屬 7 次跨膜 G 蛋白耦聯(lián)受體，主要表達于單核/巨噬細胞和淋巴細胞，與其配體介導 CCR5+免疫細胞的趨化、募集和免疫過程[6,7]。因此，本研究想觀察2-DG能否促進γδT細胞趨化因子受體CCR5的表達以及對γδT細胞的增殖和殺傷功能的影響，旨在獲得向腫瘤組織高趨向性和高殺傷活性的γδT細胞。

1材料與方法

1.1材料2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)購自Sigma公司，用RPMI1640培養(yǎng)基溶解配制母液為1 mol/L，-20℃儲存；RPMI1640和小牛血清購自Gibco 公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；重組人白細胞介素-2(rhIL-2)和唑來磷酸購自諾華制藥公司；熒光抗體FITC-γδTCR、PE-CCR5、PE-CD107a和PE-穿孔素購自eBioscience；人AB型血清購自徐州市血站。

1.2方法

1.2.1γδT細胞的培養(yǎng)取抗凝外周血20 ml，加入淋巴細胞分離液，分離獲得人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。將PBMCs加入含10%小牛血清、5% AB血清、5 μmol/L的唑來膦酸和300 U/ml的rhIL-2的γδT培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每3 d補加更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2γδT細胞鑒定將培養(yǎng)10 d的γδT細胞在倒置顯微鏡下進行形態(tài)觀察，并用FITC-γδTCR 抗體標記細胞用流式細胞儀進行γδT細胞鑒定。

1.2.32-DG對γδT細胞增殖的影響取培養(yǎng)10 d的γδT細胞，調(diào)整細胞數(shù)至1.0×105ml-1，取180 μl 接種于96孔板，加入終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L 2-DG，每組設(shè)4個復孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl的CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后于450 nm 處測定光密度值。

1.2.42-DG對γδT細胞上顆粒酶和穿孔素的表達將γδT細胞配成濃度為1.0×105ml-1的細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L的2-DG，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細胞并用PBS洗滌2次，每管加入anti-γδTCR-FITC 10 μl,避光孵育20 min。加入100 μl固定液室溫避光孵育15 min，PBS洗滌1次。每管加100 μl破膜液,10 μl anti-穿孔素-PE 抗體及anti-顆粒酶B-PE 抗體，室溫避光孵育15 min,PBS洗滌后,重懸于0.5 ml的PBS溶液中，分別用流式細胞術(shù)檢測顆粒酶和穿孔素的表達，試驗重復3次。

1.2.52-DG對γδT細胞上CD107a和CCR5的表達將γδT細胞配成濃度為1.0×105ml-1的細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 ml，然后加入終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L的2-DG，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集細胞并用PBS洗滌2次，每管分別加入10 μl的anti-γδTCR-FITC、anti-CCR5-PE和anti-CD107a-PE，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細胞術(shù)檢測CCR5和CD107a的表達，試驗重復3次。

1.2.62-DG對γδT細胞殺傷HCT116細胞活性的影響取對數(shù)生長期HCT116細胞作為靶細胞，接種于96孔板中密度為5×103/孔，以10∶1的效靶比分別加入γδT細胞，總體積為200 μl/孔，同時設(shè)立空白對照組、效應(yīng)細胞對照組和靶細胞對照組，每組設(shè)4個復孔。效應(yīng)細胞與靶細胞共同孵育24 h后，加入CCK-8液20 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標儀450 nm處檢測光密度值。

2結(jié)果

2.1γδT細胞鑒定和2-DG對γδT細胞增殖的影響分離獲得人外周血單個核細胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用γδT細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，2 d 后γδT細胞開始增殖，10 d后出現(xiàn)許多大小不同的細胞集落，細胞成梭形(圖1A)。用流式細胞儀鑒定結(jié)果如圖1B顯示，γδT細胞比率達(88.18±3.41)%。以上結(jié)果提示γδT 細胞培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實驗。

圖1　2-DG對γδT細胞增殖的影響Fig.1　Effect of treatment of 2-DG on γδT cell proliferative responseNote: *.P<0.01.

圖2　2-DG對γδT細胞CCR5表達的影響Fig.2　Effect of 2-DG on expression of CCR5 in γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

增殖實驗結(jié)果顯示(圖1C)：經(jīng)不同濃度的2-DG作用γδT細胞48 h后，2-DG濃度在0~1.0 mmol/L范圍內(nèi)對γδT細胞的增殖影響不明顯(P>0.05)，而當濃度大于1.0 mmol/L后能顯著抑制γδT細胞的增殖(P<0.01)。

2.22-DG促進γδT細胞趨化因子受體CCR5的表達CCR5是表達于γδT淋巴細胞表面的主要趨化因子受體蛋白之一，介導 CCR5+γδT細胞的趨化、募集和免疫過程。本實驗研究結(jié)果顯示，2-DG作用γδT細胞48 h后，能顯著促進γδT細胞表面CCR5受體的表達，且具有劑量依賴性(P<0.05,P<0.01),見圖2。

2.32-DG對γδT細胞中顆粒酶、穿孔素和CD107a表達的影響2-DG作用γδT細胞48 h后,流式檢測結(jié)果如圖3顯示,經(jīng)0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的2-DG作用后，γδT細胞穿孔素和CD107a的陽性表達率較對照組升高，以濃度1.0 mmol/L濃度最明顯分別為(62.47±2.29)%和(52.45±2.08)%，與對照組(46.35±2.31)%和(43.39±1.83)%比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而在0~2.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)對顆粒酶的表達影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3　2-DG作用γδT細胞48 h后對CD107a和穿孔素表達的影響Fig.3　Effect of 2-DG on expression of CD107a and perforin in γδT cells

圖4　2-DG處理后的γδT細胞對結(jié)腸癌HCT116細胞殺傷效應(yīng)Fig.4　Killing activities of γδT cells treated with 2-DG against HCT116 cells

2.4γδT細胞對結(jié)腸癌HCT116細胞殺傷作用經(jīng)0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的2-DG處理48 h后的γδT細胞，在效靶比為10∶1時對結(jié)腸癌HCT116細胞的殺傷率分別為：(49.28±2.76)%和(57.92±3.17)%。與對照組(38.34±2.16)%相比，經(jīng)2-DG處理后的γδT細胞對結(jié)腸癌HCT116細胞殺傷效率顯著高于對照組(P<0.05,P<0.01)，見圖4。

3討論

γδT細胞是T淋巴細胞中表達γδTCR的一個亞群，約占外周血T淋巴細胞的0.5%~5%，在機體的抗感染、抗腫瘤和免疫監(jiān)視等方面起到重要作用[8]。因γTδ 細胞能夠識別腫瘤表達的磷酸化抗原和應(yīng)激抗原等，能通過穿孔素和顆粒酶以及NKG2D等途徑殺傷多種腫瘤細胞，因此近年來體外常規(guī)擴增的γδT細胞成為腫瘤過繼免疫治療的重要候選細胞[9]。為了提高γδT細胞治療效果，目前國內(nèi)外研究主要集中于通過多種細胞因子和中藥單體化合物等進行誘導培養(yǎng)γTδ細胞及條件優(yōu)化，來提高γTδ細胞的體外增殖倍數(shù)及殺傷功能[10-14]。然而，臨床回輸?shù)摩肨δ 細胞在體內(nèi)有效地遷移到腫瘤局部，是發(fā)揮免疫監(jiān)視和抗腫瘤活性的一個重要條件。

CCR5 為趨化因子 CC 受體家族成員，主要表達于單核/巨噬細胞和淋巴細胞且在γδT 細胞上的表達顯著高于αβT 細胞，與其配體為CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP-1β)、CCL5(RANTES)介導CCR5+免疫細胞的趨化、募集和免疫過程[4,5]?？祵幍萚15]研究人員發(fā)現(xiàn)體外擴增的 γTδ細胞表面高表達趨化因子受體 CCR5，而且還發(fā)現(xiàn)CCR5 的配體CCL3、CCL4 和 CCL5三種趨化因子在部分結(jié)直腸癌標本中高表達，提示了其募集 γδT細胞的可能性。另外，γδT細胞還具有抗原提呈功能，荷載腫瘤抗原的γδT細胞高表達CCR5可能會增強其誘發(fā)機體適應(yīng)性抗腫瘤免疫能力，為γδT細胞腫瘤疫苗的臨床應(yīng)用提供支持[16]。

本研究中發(fā)現(xiàn)2-DG在0~1.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)對γδT細胞的增殖影響不明顯，相反當濃度大于1.0 mmol/L后能顯著抑制γδT細胞的增殖。殺傷活性僅在2-DG濃度為 0.5 mmol/L和1.0 mmol/L時，可以提高γδT細胞穿孔素、CD107a的陽性表達率和對人結(jié)腸癌細胞HCT116的體外殺傷力。而在0~2.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)，2-DG能顯著地促進γδT細胞趨化因子受體CCR5的表達，且具有劑量依賴性，提示用2-DG誘導培養(yǎng)的γδT細胞回輸?shù)襟w內(nèi)后可能具有更好的腫瘤組織趨向性。

本研究結(jié)論是1.0 mmol/L的 2-DG作用γδT細胞48 h后，在不影響γδT細胞增殖的情況下能獲得高殺傷活性和高表達CCR5+γδT細胞。我們研究結(jié)果為進一步提高γδT細胞治療腫瘤提供了實驗依據(jù)。而有關(guān)該群細胞具體的生物學特性、體內(nèi)趨向性和抗腫瘤療效等有待進一步研究。

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[收稿2015-06-06]

(編輯張曉舟)

[關(guān)鍵詞]2-DG;γδT細胞;CCR5；殺傷功能

Effect of 2-deoxy-D-glucoseon on expression of CCR5 and killing function of human γδT cells in vitro

ZHENGLu,CHENYong-Qiang,LIUJun-Quan,LüXiao-Ting,ZHANGJuan,SUNLei-Qing,XUJing,ZHOUZhong-Hai,CHENFu-Xing.DepartmentofCentralLaboratory,97thHospitalofPLA,Xuzhou221004,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of 2-deoxy-D-glucose (2-DG) on hunman γδT cells on the expression of CCR5 and killing function in vitro.Methods: Using γδT medium to cultivate peripheral blood mononuclear cell(PBMCs) in vitro.After co-cultured with various concentrations of 2-DG for 48 h,the expression of CCR5 and killing activities of γδT cells for each group were detected by flow cytometry and CCK-8 methods.Results: 2-DG could not promote the growth of γδT cells with the increase in concentration from 0 μmol/L to 1.0 μmol/L and decreased thereafter.The certain concentration (0-2.0 μmol/L) of 2-DG could upregulate the expression of CCR5 in dose dependent manner.Besides，at 0.5 μmol/L and 1.0 μmol/L of 2-DG could increase the expression of CD107a and perforin and have no effect on the granzyme B.Conclusion: Human γδT cells isolated from peripheral blood treated with 2-DG could promote the expression of CCR5 and increase the killing activities at certain concentration in vitro.

[Key words]2-DG;γδT cells;CCR5;Killing function

通訊作者及指導教師：周忠海(1973年-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:zhouzhonghai298@aliyun.com。

作者簡介：鄭璐(1985年-)，女，碩士，主管技師，主要從事分子藥理學方面的研究，E-mail:xsdzhenglu@163.com。

中圖分類號R392.12
①本文受南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新研究基金(14MS032) 資助。
②并列第一作者。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0029-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.006