單圣帥　王博遠　凱　山　林吉斌　林　靜　李大主

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430022)

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·臨床免疫學(xué)·

轉(zhuǎn)錄因子BACH2在冠心病患者外周血單個核細胞中的表達及意義①

單圣帥王博遠凱山林吉斌林靜②李大主

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430022)

[摘要]目的：研究轉(zhuǎn)錄因子BACH2在冠心病(CAD)患者外周血單個核細胞中的表達水平，并探討其在冠心病發(fā)病中的意義及作用機制。方法：采用密度梯度離心法分離急性冠脈綜合征(ACS)、穩(wěn)定型心絞痛(SA)和正常對照組(NS)三組受試者外周血單個核細胞(PBMC)；采用RT-PCR和Western blot法檢測不同組別PBMC中BACH2及TLR4的表達量；采用ELISA法檢測不同組別血清ox-LDL及TH1,TH2，TH17 和 Treg細胞各自標(biāo)志性細胞因子(IFN-γ,IL-4,IL-17 和 TGF-β1)的水平。組間差異的比較使用方差齊性分析，各變量之間的相關(guān)性使用直線回歸分析。結(jié)果：ACS組病人PBMC中的BACH2表達顯著下調(diào)，TLR4表達顯著上調(diào)。ACS組血清ox-LDL及IFN-γ、IL-4、IL-17水平較SA組和NC組顯著升高，而TGF-β1顯著降低。CAD患者PBMC中的BACH2表達量與TLR4表達水平顯著負相關(guān)；BACH2表達量與IFN-γ、IL-4和IL-17水平負相關(guān)，與TGF-β1水平顯著正相關(guān)。結(jié)論：冠心病患者循環(huán)中的BACH2表達降低；CAD病人循環(huán)中高濃度的ox-LDL可能通過激活TLR4抑制BACH2的表達，進而造成CD4+T細胞亞群分化和發(fā)育失調(diào)以及炎癥因子分泌紊亂,從而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生和發(fā)展。

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種慢性炎癥性疾病，多種炎癥細胞(如CD4+T細胞、單核-巨噬細胞)和炎癥因子在其中發(fā)揮重要作用[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)特別是Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)識別并接受氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)的刺激，導(dǎo)致抗原提呈細胞的激活，以及作為T細胞的共刺激信號促進T細胞激活，激活的T細胞產(chǎn)生炎癥因子網(wǎng)絡(luò)，并進一步激活多種免疫細胞，引發(fā)并促進AS炎癥反應(yīng)[1-3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細胞轉(zhuǎn)錄抑制劑BTB和CNC同源類似物2(B lymphoid transcription repressor BTB and CNC homology 2，BACH2)是CD4+T細胞分化和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它通過維持免疫激活與免疫耐受之間的平衡防止炎癥性疾病的產(chǎn)生[4]。BACH2與哮喘、克羅恩病、乳糜瀉、白癜風(fēng)、多發(fā)性硬化、肺炎等多種免疫性和炎癥性疾病有關(guān)[5-10]。BACH2是否也參與AS的炎癥反應(yīng)目前尚不清楚。本研究通過檢測BACH2及TLR4在冠心病患者PBMC中的表達，以及循環(huán)中的ox-LDL及冠心病相關(guān)炎癥因子(IFN-γ,IL-4,IL-17和TGF-β1)的水平，探討B(tài)ACH2在AS發(fā)病中的意義及可能的作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑RT-PCR試劑盒購自TakaRa公司；PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司引物合成；檢測人源性IFN-γ，IL-4，IL-17，TGF-β 1酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自RayBiotech公司；ox-LDL ELISA試劑盒購于上海Westang Biotech公司；淋巴細胞分離液購于Axis-Shield公司；用于蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)的anti-BACH2抗體購于Aviva Systems Biology公司；anti-TLR4抗體購于eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1研究對象挑選2013年11月至2014年9月在武漢協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科住院病人共110例，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)分三組：急性冠脈綜合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)組35例，穩(wěn)定型心絞痛(Stable Angina，SA)組35例和正常對照組(Normal Control,NC)40例。ACS及SA的納入標(biāo)準(zhǔn)采用新近中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會制定的冠心病診斷指南，NC組選取正常體檢人群。納入的三組受試者需滿足以下條件：排除患有其他急慢性炎癥性疾病；未使用抗炎藥物及免疫抑制劑；無腫瘤性疾病；無急慢性腎衰竭及肝功能衰竭。

1.2.2樣本采集所有受試者于入院24 h內(nèi)采集外周血10 ml并置于肝素抗凝的無菌試管中，采集后立即離心取上層血清-80℃保存?zhèn)溆茫鍢?biāo)本保存不超過30 d。

1.2.3密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC) 將采集的肝素抗凝靜脈血離心去上層血清后，使用PBS稀釋并轉(zhuǎn)移到含淋巴細胞分離液上。按照密度梯度離心法獲得PBMC。

1.2.4RT-PCR檢測不同組別PBMC中BACH2及TLR4的mRNA表達按RT-PCR試劑盒提供方法進行,反轉(zhuǎn)錄后PCR,β-actin為內(nèi)參(所用引物見表1)。采用 2-ΔΔCt算法分析結(jié)果。

1.2.5Western blot檢測不同組別PBMC中BACH2及TLR4的蛋白質(zhì)表達提取PBMC總蛋白并使用BCA法測蛋白濃度。每孔上樣50ug蛋白質(zhì)，蛋白變性后10 % SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉，加一抗(anti-BACH2 1∶500,anti-TLR4 1∶200)孵育后再加入二抗孵育。最后加入熒光檢測試劑，UVP凝膠成像系統(tǒng)進行圖像分析。

1.2.6ELISA法檢測不同組別血清ox-LDL及細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1的濃度根據(jù)說明書檢測不同組別血清ox-LDL及IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1的濃度。

2結(jié)果

2.1不同組別的臨床特點三組受試者的年齡、性別、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史及脂質(zhì)代謝紊亂病史無明顯差異。ACS組病人的既往發(fā)病史及PCI史比其他組更常見。ACS組、SA組兩組的藥物使用情況相似且比陰性對照組更常見(表2)。

表1PCR引物

Tab.1PCR primers

PrimersForward(5'-3')Reverse(5'-3')BACH2ATGCACAAGCTAACCTCAGATCACTAGGTATAATCTTTCCTGTLR4TACAAAATCCCCGACAACCTCCGCTGCCTAAATGCCTCAGGGβ-actinATCTGGCACCACACCTTCTACGAGGCGTACAGGGATAGCAC

2.2臨床生化指標(biāo)檢測結(jié)果包括總膽固醇、LDL、HDL、甘油三酯、血糖、白細胞計數(shù)和血肌酐水平(表3)。不同組別的LDL、HDL、甘油三酯、血糖水平無顯著差異。ApoA1 和ApoB在三組受試者中有差異。與SA和NC相比，ACS組的白細胞計數(shù)有輕度升高。

2.3BACH2在不同組別PBMC中的表達RT-PCR表明,和NS組相比，ACS和SA組PBMC中的BACH2 mRNA表達量顯著下降(NC;1.00±0.02,ACS;0.265±0.06,SA;0.552±0.115,P<0.001)。而且，和SA組相比，ACS組也有顯著下降(P<0.001)(圖1A)。Western blot結(jié)果與RT-PCR相似，ACS組BACH2蛋白質(zhì)的表達顯著減少(P<0.001，ACS vs NCP<0.001，SA vs NCP<0.001)。ACS組與SA組相比亦顯著減少(ACS vs SAP<0.001)(圖1B)。

2.4TLR4在不同組別PBMC中的表達RT-PCR表明,ACS和SA組TLR4 mRNA表達明顯增加(ACS;1.85±0.65,SA;1.52±0.34,NC;1.00±0.00,P<0.05)，ACS和SA組相比亦有顯著差別(P<0.05)(圖2A)。Western blot表明,ACS組病人TLR4蛋白表達顯著增高(ACS vs NCP<0.001),ACS和SA組相比亦有顯著差別(ACS vs SAP<0.05)(圖2B)。

2.5PBMC中的BACH2與TLR4之間的相關(guān)性直線回歸分析表明，在全部受試者PBMC中,BACH2與TLR4的表達量之間存在顯著負相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(r2= 0.93,P<0.000 1) (圖3)。

表2不同組別的臨床特點[n(%)]

Tab.2Baseline clinical characteristics of the three groups of subjects[n(%)]

CharacteristicsNC(n=40)SA(n=35)ACS(n=35)PvalueAge(Years)56.75±8.6657.71±9.3459.49±8.62NSFemalegender(%)15(37.5)12(34.3)12(34.3)NSRiskfactorsHypertension11(27.5)14(40)17(48.6)NSDiabetes4(10.0)7(20.0)9(25.7)NSSmoking11(27.5)9(25.7)15(42.86)NSDyslipidaemia7(17.5)9(25.7)11(31.4)NSFamilyhistoryofCAD5(12.5)8(22.9)11(31.4)NSCurrentmedicationAspirin6(15.0)10(28.6)1)16(45.7)<0.05(0.014)β-Blockers3(7.5)7(20.0)1)15(42.9)<0.05(0.001)ACEinhibitors4(12.5)8(22.86)1)12(33.33)<0.05(0.039)Statins4(10.0)11(31.4)1)15(42.9)<0.05(0.005)CCB3(7.5)6(17.1)1)11(31.4)<0.05(0.027)ClinicalhistoryPreviousACS-4(11.4)2)6(17.1)<0.031PreviousPCI-2(5.7)2)5(14.29)<0.040

Note：1)SA vs NC;2)SA vs ACS.

2.6不同組別血清中炎癥因子(pg/ml)的含量ELISA結(jié)果表明，ACS組的IFN-γ分泌量顯著升高(ACS 48.64±2.548,NC 28.54±1.718,SA 39.96± 1.815；ACS vs NCP<0.0001，ACS vs SAP=0.007 1)。ACS組的IL-4 和IL-17水平亦顯著升高(IL-4：ACS 9.033±0.672,NC 6.206±0.337,SA6.918±0.306 1；ACS vs NCP=0.000 4,ACS vs SAP=0.005 6。IL-17:ACS 178.6± 5.475,NC 98.65±2.614,SA 131.9 ± 5.197；ACS vs NCP<0.000 1,ACS vs SAP<0.0001)。然而，ACS組的TGF-β1水平顯著降低(ACS 89.72±1.949,NC 103.3±2.045,SA 7.16±1.757；ACS vs NCP<0.000 1,ACS vs SAP=0.006 0)(圖4)。

表3不同組別的臨床生化指標(biāo)檢測結(jié)果

Tab.3Biochemical indicators of the three groups of patients

InvestigationsNC(n=40)SA(n=35)ACS(n=35)PvalueTotalcholesterole(mmol/L)4.31±1.044.22±1.164.62±1.25NSLDLcholesterol(mmol/L)1.96±0.962.47±1.203.17±1.14NSHDLcholesterol(mmol/L)1.33±0.461.15±0.831.02±0.79NSTriglycerides(mmol/L)1.37±0.671.54±0.831.67±0.96NSApoA1(g/L)1.25±0.331.18±0.472)1.13±0.36<0.05ApoB(g/L)0.69±0.770.84±0.612)0.98±0.38<0.05Glucose(Fasting)(mmol/L)5.21±0.655.63±0.836.01±0.69NSWhitebloodcells(x109/L)7.82±2.017.75±1.048.59±1.491)<0.05Creatinine(μmol/L)76.44±1.6281.49±1.3788.91±0.81NS

Note：1)ACS vs NC and SA;2)SA vs NC.

圖1　不同組別PBMC中BACH2的表達Fig.1　Expression levels of BACH2 on PBMC in NC,SA and ACS groupsNote: A.RT-PCR analysis of BACH2 mRNA expression levels in three groups.B.Western blot analysis of BACH2 protein level in three groups.Gray levels were normalized against β-actin (ACS vs NC P<0.001，ACS vs SA P<0.001，SA vs NC P<0.001).

圖2　不同組別的PBMC中的TLR4表達Fig.2　Measurement of TLR4 expression levels on PBMC in three groups

圖3　PBMC中的BACH2與TLR4之間的相關(guān)性Fig.3　Correlation between expression levels of BACH2 and TLR4 in all subjects

圖4　不同組別血清中炎癥因子的含量Fig.4　Serum levels of Th1 (IFN-γ),Th2 (IL-4),Th17 (IL-17) and Treg (TGF-β1) cytokines among groups

圖5　轉(zhuǎn)錄因子BACH2與炎癥因子的相關(guān)性Fig.5　Correlation between expression levels of BACH2 and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in all subjects of three groups

2.7BACH2與炎癥因子的相關(guān)性直線回歸分析表明，在所有受試者中，BACH2與IFN-γ(r=-0.62，P<0.000 1),IL-4(r=-0.32,P=0.007 3)和IL-17(r=-0.52，P<0.000 1)負相關(guān)，與抑炎因子TGF-β1(r=0.74，P<0.000 1)顯著正相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

2.8不同組別血清ox-LDL(μg/ml)的濃度ACS組血清ox-LDL 顯著升高(ACS 32.35±0.701,SA 22.23±0.642 0,NC 15.28±0.427 1,ACS vs NCP<0.000 1 ；ACS vs SAP<0.000 1)。SA組與NC組相比，ox-LDL亦顯著升高(P<0.000 1)，見圖6。

2.9BACH2與ox-LDL的相關(guān)性直線回歸分析表明，PBMC中的BACH2表達量與血清ox-LDL濃度顯著負相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.78，P<0.000 1)，見圖7。

圖6　不同組別血清ox-LDL的濃度Fig.6　Circulating concentrations of ox-LDL in threegroups

圖7　PBMC中的BACH2表達量與血清ox-LDL濃度的相關(guān)性Fig.7　Correlation between expression levels of BACH2 in PBMC and concentrations of ox-LDL in serum in all subjects of three groups

3討論

CD4+T細胞亞群通過促進或抑制AS的炎癥反應(yīng)參與AS發(fā)生發(fā)展[11]。TH1細胞引發(fā)的促炎反應(yīng)在AS中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而TH2和TH17細胞在AS中的作用目前還存在爭議，Treg通過產(chǎn)生抑制炎癥的細胞因子在防止AS方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。然而，CD4+T細胞在CAD炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機制目前尚不清楚。

新近研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子BACH2是CD4+T細胞分化和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，BACH2通過抑制效應(yīng)程序穩(wěn)定Treg細胞介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。具有效應(yīng)細胞特異性功能的Map3k8，以及Gata3、Irf4、Nfil3和Ahr，分別對TH1、TH2和TH17細胞分化具有重要作用[12-16]，BACH2通過抑制這些基因的表達，從而對TH1、TH2和TH17細胞的分化發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。BACH2敲除的小鼠T細胞顯示出自發(fā)激活，并引起TH1/TH2型細胞因子產(chǎn)生增加，而Treg細胞表現(xiàn)出Foxp3表達量減少，細胞數(shù)量減少，進而導(dǎo)致嚴重的肺部慢性炎癥病變[10]。因此，BACH2在維持免疫穩(wěn)態(tài)防止炎癥性疾病方面發(fā)揮重要作用。BACH2是否也參與了AS的炎癥反應(yīng)，目前尚未見報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比，CAD患者循環(huán)中的BACH2表達顯著降低。這是我們首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BACH2與AS相關(guān)，這表明BACH2可能參與了AS的炎癥反應(yīng)。

為了探討B(tài)ACH2是否調(diào)控了CD4+T細胞在CAD的炎癥反應(yīng)，我們檢測了CAD和正常人群體內(nèi)CD4+T細胞亞群分泌的標(biāo)志性炎癥因子IFN-γ(Th1)、IL-4 (Th2)、IL-17(Th17)和TGF-β1(Treg)的水平。我們發(fā)現(xiàn)，ACS病人循環(huán)水平的IFN-γ、IL-4、IL-17顯著升高，而TGF-β1顯著降低。這與文獻報道的結(jié)果是一致的。直線回歸分析顯示，BACH2表達量與IFN-γ、IL-4和IL-17的分泌量呈負相關(guān)，而與TGF-β1的分泌量呈顯著正相關(guān)，提示BACH2可能通過調(diào)控CD4+T細胞的分化和發(fā)育及相關(guān)炎癥因子的分泌，進而在冠心病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

研究證實，ox-LDL是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵危險因素[17]。為了進一步探討B(tài)ACH2與AS危險因素之間的關(guān)系，本研究組檢測了CAD患者和正常人群血清ox-LDL。我們發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比，CAD患者血清ox-LDL濃度顯著升高。直線回歸分析表明,PBMC中的BACH2表達量與ox-LDL濃度顯著負相關(guān)。這提示ox-LDL可能通過抑制BACH2的表達發(fā)揮致AS作用。但是，ox-LDL是通過何種方式抑制BACH2的表達還需探討。

TLR4是ox-LDL致AS作用的重要配體，TLR4識別并接受ox-LDL的刺激，導(dǎo)致單核-巨噬細胞和T細胞激活，促進炎癥因子產(chǎn)生，引發(fā)AS炎癥反應(yīng)[2]。因而我們推測，ox-LDL有可能通過TLR4抑制BACH2的表達。我們檢測了CAD和正常人群PBMC中的TLR4的表達。結(jié)果表明，ACS病人循環(huán)中的TLR4表達顯著上調(diào)。直線回歸分析顯示，PBMC中的BACH2量與TLR4顯著負相關(guān)。提示ox-LDL可能是通過TLR4抑制了BACH2的表達。

綜上所述，CAD患者循環(huán)中高濃度的ox-LDL可能通過激活TLR4抑制BACH2的表達，進而造成下游的CD4+T細胞亞群分化和發(fā)育失調(diào)以及相關(guān)炎癥因子分泌紊亂，從而導(dǎo)致CAD的發(fā)生和發(fā)展。上述發(fā)現(xiàn)不僅證實了BACH2與AS的相關(guān)性，還為進一步闡明BACH2在AS炎癥中的作用和機制提供依據(jù)，為冠心病防治提供了潛在的新靶點，因而具有重要的臨床意義。

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[收稿2015-06-13]

(編輯許四平)

[關(guān)鍵詞]冠心?。晦D(zhuǎn)錄因子BACH2；Toll樣受體4；炎癥因子

Expression of transcription factor BACH2 and its significance on PBMC in patients with coronary artery disease

SHANSheng-Shuai,WANGBo-Yuan,KaiShan,LINJi-Bin,LINJing,LIDa-Zhu.DepartmentofCardiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of transcription factor BACH2 on PBMC in patients with coronary artery disease(CAD) and discuss its significance and role.Methods: The circulating levels of BACH2 and TLR4 in PBMC were evaluated by RT-PCR and Western blot separately.Serum levels of signature cytokines of T-helper cells,cytokines and ox-LDL were evaluated by ELISA.The data among groups were analyzed by one-way ANOVA.Correlation between variables were subjected to linear regression analysis.Results: The expression level of BACH2 down-regulated and TLR4 up-regulated significantly in PBMCs of ACS patients had significantly higher concentrations of serum ox-LDL,cytokines of TH1 cells,TH2 cells and TH17 cells and low level of cytokine of Treg cells.Negative correlation exists significantly between BACH2 and TLR4 in patients with CAD and between BACH2 and IFN-γ,IL-4 and IL-17,and between BACH2 and ox-LDL in serum.However,positive correlation exists significantly between BACH2 and TGF-β1.Conclusion: Increased serum concentrations of ox-LDL probably down-regulated the expression of BACH2 in ACS patients by activating TLR4 on PBMC,resulting in promoting production of pro-inflammatory cytokines and suppressing production of anti-inflammatory cytokine and then might cause ACS.

[Key words]Coronary artery disease；Transcription factor BACH2；TLR4；Inflammatory cytokines

通訊作者及指導(dǎo)教師：李大主(1963年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究，E-mail:lidazhuhp@sohu.com。

作者簡介：單圣帥(1985年-)，男，在讀博士，主要從事動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究，E-mail:shanshengshuai@163.com。

中圖分類號R392.12
①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81370406)。
②陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，西安710068。

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0069-06

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.015