石理華　劉　乾　劉　沙③　梁彥軍　趙國平　李　瑛　胡役蘭　李　輝　魏茂提

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟病學(xué)研究所，天津300162)

?

我國部分漢族人群MYH9多態(tài)性與終末期腎病的關(guān)聯(lián)研究①

石理華劉乾②劉沙②③梁彥軍趙國平④李瑛胡役蘭④李輝魏茂提④

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟病學(xué)研究所，天津300162)

①本文受武警后勤學(xué)院博士啟動金課題支持(No.WHB2013010，WHB201208)。

②共同第一作者。

③武警西藏總隊醫(yī)院，拉薩850000。

[摘要]目的： 探索我國部分漢族人群非肌性肌球蛋白9(MYH9)基因第22號外顯子與24號外顯子間基因序列多態(tài)性與終末期腎病(ESRD)的關(guān)系。方法：采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究設(shè)計，納入180例ESRD患者，并選擇同期體檢118例作為對照人群。采用PCR后測序策略檢測MYH-9基因多態(tài)性，運(yùn)用Phase2.0軟件計算多態(tài)性位點連鎖關(guān)系，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析采用網(wǎng)絡(luò)AliBaba2軟件完成。結(jié)果：采用雙向測序共發(fā)現(xiàn)8個基因片段多態(tài)性位點，其中5個為新發(fā)多態(tài)性位點，3個為以前報道的多態(tài)性位點。新發(fā)多態(tài)性位點中，有2個多態(tài)性位點(G489A和A616C)位于MYH9基因第23內(nèi)含子中。關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，G489A僅存在于ESRD患者中，與對照組比較有顯著差別(P=0.013)，該結(jié)果提示該基因轉(zhuǎn)換可能是危險因素。以前文獻(xiàn)報道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)及Rs4821481(MYH9-787)未見與ESRD相關(guān)。連鎖分析結(jié)果顯示TCTCGGAT為最常見連鎖形式，但ESRD人群該連鎖基因型頻率稍低于對照組，而TCTCGGCT和TCTCAGAT在ESRD人群出現(xiàn)頻率較對照人群高。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析，MYH9基因第23內(nèi)含子的野生型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點數(shù)量少于基因突變后的數(shù)量。結(jié)論：我國漢族人群MYH9基因23內(nèi)含子附近基因序列的多態(tài)性及其連鎖關(guān)系可能與ESRD發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)，該基因可能通過基因突變造成該區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點數(shù)量改變來影響疾病的進(jìn)程。

終末期腎病(End-stage renal disease ESRD)是一種腎臟各項功能幾乎完全衰竭的常見的復(fù)雜性疾病，需要通過腎臟替代治療即腎移植或透析來維持生命，是慢性腎病的最終結(jié)局。環(huán)境和遺傳因素被認(rèn)為是ESRD發(fā)生及進(jìn)展的原因。在遺傳因素中，載脂蛋白L1(Apolipoprotein L1 gene，APOL1)和非肌性肌球蛋白9(The non-muscle myosinⅡ A gene 9， MYH9)基因多態(tài)性是大多數(shù)ESRD的易感因素[1,2]。MYH9基因第23號內(nèi)含子的rs4821480、rs2032487和rs4821481位點以及第13號內(nèi)含子的rs3752462位點上的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)及連鎖基因型與慢性腎病相關(guān)[2-4]。然而，這種易感性在不同種族之間存在明顯的不同。如，O′Seaghdha等[5]研究證實MHY9/APOL1區(qū)域的rs4821480位點的SNP與歐洲裔非糖尿病腎病相關(guān)，但這種相關(guān)唯獨在非洲裔人群中存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，E-1等位基因(GCCT)在亞洲人群分布更少[6]?？梢姡煌N族的MHY9基因多態(tài)性與ESRD的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

MYH9基因長度為139 389個堿基，含有40個外顯子[7]。鑒于MYH9基因在ESRD中的重要作用和不同民族分布差異，本研究納入漢族人群作為研究對象，探索MYH9基因多態(tài)性與ESRD的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對象選擇本研究獲得武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會同意，并與參與者簽訂知情同意書。本實驗采用病例對照研究設(shè)計，病例組選擇中國北方某醫(yī)院血液透析中心行維持性血液透析的患者370例，符合ESRD診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過充分溝通，共211例患者同意為本實驗提供血樣，2012年6~8月間分別對211例患者進(jìn)行標(biāo)本采集。對照組人員來自該醫(yī)院同期進(jìn)行健康體檢的部分醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員1 210例，經(jīng)年齡、性別、民族等混雜因素匹配之后根據(jù)課題組實際情況，共選取對照118例。

所有病例組患者均為中國漢族人群，主要來自華北地區(qū)，明確診斷為ESRD患者，于該院透析中心行血液透析治療時間1~17年，平均(5±3.3)年。納入研究211例，其中男127，女81例。但是，本研究中成功獲得MYH-9基因多態(tài)性的樣本是180例，男107，女73例，31例未能獲得MYH-9基因多態(tài)性結(jié)果。平均年齡(53.13±11.29)歲，平均BMI指數(shù)22.75±3.76。ESRD病人中，包括慢性腎小球腎炎46.41%(97/209)、糖尿病腎病性20.10%(42/209)、高血壓腎損害性11.48%(24/209)、梗阻性腎病6.22%(13/209)、家族遺傳性多囊腎性1.44%(3/209)、狼瘡腎炎性及腎臟腫瘤原因?qū)е碌腅SRD患者與其他能區(qū)分具體原因的14.35%(30/209)等。對照組患者均為中國北方漢族人群，共118例(此為實際有效的對照組人數(shù))，其中男性70例，女性48例，平均年齡(50.5±11.43)歲，排除各類泌尿系統(tǒng)內(nèi)科及外科疾病、妊娠、自身免疫性疾病、近期感染、手術(shù)、創(chuàng)傷等疾病。病例組和對照組在性別(ESRD：男/女為82/127；對照組：男/女為48/70)無顯著差異(χ2=0.07,df=1,P=0.80)。兩組研究對象年齡段分布無顯著差異(χ2=7.23,df=5,P=0.30)。

1.2實驗方法本次研究實驗室技術(shù)主要采用聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序分型技術(shù)(PCR-SBT)，主要過程包括：全血白細(xì)胞分離、全基因組DNA提取、含有特異SNP位點的基因片段擴(kuò)增和測序。參考MYH-9基因發(fā)表的基因序列(GenBank accession number：3135984)設(shè)計引物(由www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站的工具Primer設(shè)計PCR引物)。上游引物5′-ATGACTCGCCCGGAAATCTG-3′和下游引物5′-AGCATGAGGGCTTCTGCTTA-3′(引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司，中國北京)合成。PCR反應(yīng)體系:10×buffer 3 μl，上下游引物(10 mmol/L)各0.25 μl，dNTP (2.5 mmol/L)0.5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.5 μl，DNA 模板5 μl，雙蒸水加至30 μl。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接送公司測序。

根據(jù)測序結(jié)果人工判讀多態(tài)性位點。測定點出現(xiàn)單峰，即該位點為純合子型，出現(xiàn)雙峰該位點為雜合子型。國外研究提示，MYH9基因rs4821480位點上可能出現(xiàn)TT或GG純合子單峰表現(xiàn)，也可能是T/G雜合子的雙峰表現(xiàn)；MYH9基因rs4821481位點上可能出現(xiàn)TT或CC純合子單峰表現(xiàn)，也可能是T/C雜合子的雙峰表現(xiàn)；MYH9基因rs2032487位點上可能出現(xiàn)TT或CC純合子單峰表現(xiàn)，也可能是T/C雜合子的雙峰表現(xiàn)；根據(jù)測定序列的峰型，判定SNP位點基因多態(tài)性結(jié)果。

2結(jié)果

2.1MYH-9基因多態(tài)性分布本研究設(shè)計納入的基因片段包含MYH-9基因Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)的3個SNP位點，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為901 bp。通過雙向測序人工判讀測序圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究中除了前期報道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)SNP位點外，還另外發(fā)現(xiàn)5個新的SNP位點。這5個新發(fā)現(xiàn)的位點位于本研究片段的119位、308位、489位、600位及616位。所有多態(tài)性位點均符合HW平衡(P>0.05)，樣本為隨機(jī)婚配群體，病例間無遺傳關(guān)系。Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)三個基因位點基因型均為TT純合子型。在新發(fā)現(xiàn)位點中，以489位(G489A)和616位(A616C)突變型最為常見，而119位(C119T)、308位(C308T)、600位(A600C)的多態(tài)性位點突變型較少(見表1)。

2.2MYH-9基因多態(tài)性與ESRD的關(guān)系489位的堿基G到A轉(zhuǎn)換僅在病例組(9/171)中出現(xiàn)，對照組中均為G，兩組有顯著差別(Fish精確檢驗，P=0.013)。616位多態(tài)性在兩組研究對象分布基本一致(χ2=1.46，df=2，P=0.227)。然而，前人報道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)三個位點多態(tài)性在中國漢族人群卻均為TT純合子型[8，9]，未見與ESRD之間相關(guān)性。

連鎖結(jié)果分析顯示，TCTCGGAT為最常見的單倍體基因型，分別占ESRD和對照組人群的90%以上，但該單倍體型病例組出現(xiàn)頻率又低于對照組趨勢。而TCTCGGCT 和TCTCAGAT單倍體型出現(xiàn)頻率卻又高于對照組的趨勢(表2)。

2.3MYH-9基因多態(tài)性對基因轉(zhuǎn)錄的影響通過對本研究MYH9基因片段的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcription factor binding sites)分析(http://www.gene-regulation.com/)，結(jié)果顯示本片段由野生型的98個增加至突變型的104個，僅在第23內(nèi)含子區(qū)這個數(shù)據(jù)就由82個增加至85個。

表1我國部分地區(qū)漢族ESRD和對照組人群MYH9基因多態(tài)性結(jié)果

Tab.1Polymorphism of MYH9 gene segment in ESRD patients and control of Han population

SNPPolymorphismCaseControlStatisticsPMYH9-119CC179117Fisher'sExactTest1.00CT10MYH9-308CC179117Fisher'sExactTest1.00CT10MYH9-489GG171117Fisher'sExactTest0.013GA90MYH9-600CC179117Fisher'sExactTest1.00CT10MYH9-616AA164111χ2=1.460.227AC166

表2我國部分地區(qū)漢族ESRD和對照組人群MYH9基因連鎖分析結(jié)果

Tab.2Linkage distribution of MYH9 gene segment SNP in ESRD patients and control of Han population

HaplotypeCaseEstimatedfrequencyS.E.ControlEstimatedfrequencyS.E.TCTCGGAT0.9187180.0018360.9700850.000001TCTCGGCT0.0436160.0012710.0256410.000000TCTCAGAT0.0285040.0018360.0000000.000000TCTCGAAT0.0027780.0000000.0042740.000000TTTCGGAT0.0027780.0000000.0000000.000000TCTTGGAT0.0015540.0013790.0000000.000000TCTTAGAT0.0012230.0013790.0000000.000000TCTCAGCT0.0008280.0012710.0000000.000000

3討論

各種原因所致的慢性腎臟疾病發(fā)展成為ESRD可能通過共同途徑所致。這些過程包括上皮細(xì)胞間質(zhì)化、炎癥、纖維化等造成腎小球和腎小管間質(zhì)化，最終造成腎臟功能喪失。通過全基因混合掃描(Genome-wide admixture scan)研究策略，比較不同遺傳背景人群ERSD發(fā)生情況的差異，成功確定ESRD的易感基因之一是MYH-9基因[2]。

MYH-9基因位于22號染色體長臂12.3-13.1區(qū)(22q12.3-13.1)，基因全長約110 kb，包含40個外顯子，該基因在遺傳過程中高度保守[7]，該基因編碼的蛋白在肝臟、腎臟及血小板中表達(dá)豐富。在腎臟，MYH-9基因編碼的產(chǎn)物主要在腎小球，特別是足細(xì)胞、腎小管周圍毛細(xì)血管、腎小管表達(dá)。肌球蛋白的異常聚集、腎小管上皮細(xì)胞及足細(xì)胞細(xì)胞骨架的損害都可能造成腎臟病的進(jìn)展。為此，MYH-9與ESRD的相關(guān)研究逐漸被人們重視。

研究顯示[2,5]，許多與腎臟病相關(guān)的MYH-9基因的SNPs位于內(nèi)含子12~23之間，跨越約14.9 kb，包括4個標(biāo)記點SNPs(rs4821480、rs2032487、rs4821481和rs3752462)。這四個SNPs同時也是組成E1風(fēng)險單倍型的主要位點。其中位于23內(nèi)含子的SNP位點，rs4821481，在各項研究中均表現(xiàn)腎臟疾病關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)、最持續(xù)，然而相對于E1風(fēng)險單倍型而言(60%非裔美洲人群，4%歐裔美洲人群)，E1有著與腎臟病更強(qiáng)的相關(guān)性[5]。為此，本研究最初也是基于對這些文獻(xiàn)發(fā)表結(jié)果分析選定已經(jīng)發(fā)表有意義的位點在我國漢族人群中進(jìn)行探索研究。然而，本研究結(jié)果顯示Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)三個位點SNP并未見與ESRD有顯著關(guān)聯(lián)，該研究結(jié)果與我國其他研究相似[8，9]。幸運(yùn)的是，本研究發(fā)現(xiàn)上述三個位點附近的其他位點SNP可能與ESRD有關(guān)。如，本研究中489位的等位基因堿基由G到A轉(zhuǎn)換僅在病例組(9/171)中出現(xiàn)，對照組中均為G等位基因，兩組有顯著差別(Fish精確檢驗，P=0.013)。進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄子分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型MYH9基因片段的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點數(shù)量顯著增加。為此，本研究推測該基因位點的多態(tài)性影響ESRD可能通過影響該基因表達(dá)來實現(xiàn)。有研究推測，MYH9 基因與ESRD相關(guān)可能直接影響慢性腎臟病患者的蛋白尿水平或者通過直接影響血壓，從而影響疾病進(jìn)展來實現(xiàn)[9]。

資料調(diào)研和本研究結(jié)果顯示，國外證實的與ESRD相關(guān)的多態(tài)性位點在我國資料中卻未見顯著關(guān)聯(lián)?？赡苡捎诓煌N族導(dǎo)致MHY9基因多態(tài)性不同，從而造成該基因多態(tài)性與ESRD的關(guān)系不同的原因。為此，我國部分漢族人群MHY9基因多態(tài)性與ERSD的關(guān)系需要進(jìn)一步研究證實。我國研究資料顯示，本研究和其他研究結(jié)果提示我國部分漢族人群MYH9基因多態(tài)性具有獨特的特點。如，本研究三個位點Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)的多態(tài)性卻均為TT純合子型，這與我國其他研究結(jié)果相近[8,9]。國際SNP數(shù)據(jù)庫結(jié)果也顯示(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP /snp_ref.cgi?rs= 2032487)亞洲人群TT基因型頻率在99.0%~100%之間，而非裔美國人這三個位點的TT型頻率分別為13.0%、13.4%和13.5%[10]。該基因相同位點多態(tài)性存在如此大差異，提示我國該基因多態(tài)性與ERSD的關(guān)聯(lián)之間可能存在獨特特點。因此，開展我國人群的MYH9基因多態(tài)性與ESRD關(guān)聯(lián)研究可能會有新的發(fā)現(xiàn)，也應(yīng)該注意我國研究結(jié)果可能與國外研究結(jié)論不同。

總之，我國漢族人群MYH9基因23內(nèi)含子附近基因序列的多態(tài)性及其連鎖關(guān)系可能與ESRD發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)，該基因可能通過基因突變造成該區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點數(shù)量改變來實現(xiàn)其作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Freedman BI,Kopp JB,Langefeld CD,etal.The apolipoprotein L1(APOL1)gene and nondiabetic nephropathy in African Americans[J].J Am Soc Nephrol,2010，21(9):1422-1426.

[2]Nelson GW,Freedman BI,Bowden DW,etal.Dense mapping of MYH9 localizes the strongest kidney disease associations to the region of introns 13 to 15[J].Hum Mol Genet,2010，19(9):1805-1815.

[3]Kopp JB,Smith MW,Nelson GW,etal.MYH9 is a major-effect risk gene for focal segmental glomerulosclerosis[J].Nat Genet,2008，40(10):1175-1184.

[4]Kao WH,Klag MJ,Meoni LA,etal.MYH9 is associated with nondiabetic end-stage renal disease in African Americans[J].Nat Genet,2008，40(10):1185-1192.

[5]O′Seaghdha CM,Parekh RS,Hwang SJ,etal.The MYH9/APOL1 region and chronic kidney disease in European-Americans[J].Hum Mol Genet,2011，20(12):2450-2456.

[6]Oleksyk TK,Nelson GW,An P,etal.Worldwide distribution of the MYH9 kidney disease susceptibility alleles and haplotypes:evidence of historical selection in Africa[J].PLoS One,2010，5(7):e11474.

[7]Heath KE,Campos-Barros A,Toren A,etal.Nonmuscle myosin heavy chain IIA mutations define a spectrum of autosomal do minant macrothrombocytopenias:May-Hegglin anomaly and Fechtner,Sebastian,Epstein,and Alport-like syndromes[J].Am J Hum Genet,2001，69(5):1033-1045.

[8]Cheng W,Zhou X,Zhu L,etal.Polymorphisms in the nonmuscle myosin heavy chain 9 gene(MYH9)are associated with the progression of IgA nephropathy in Chinese[J].Nephrol Dial Transplant,2011，26(8):2544-2549.

[9]劉麗萍，王彩麗，范俊英.MYH9 基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)慢性腎臟病患者病情進(jìn)展的相關(guān)性研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2013，14(2)：142-145.

[10]Freedman BI,Hicks PJ,Bostrom MA,etal.Polymorphisms in the non-muscle myosin heavy chain 9 gene(MYH9)are strongly associated with end-stage renal disease historically attributed to hypertension in African Americans[J].Kidney Int,2009，75(7):736-745.

[收稿2015-04-16修回2015-10-20]

(編輯倪鵬)

[關(guān)鍵詞]終末期腎病(ESRD)；非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA(MYH9)多態(tài)性；漢族人群

Association of MYH9 SNPs with end-stage renal disease in Chinese Han population

SHILi-Hua,LIUQian,LIUSha,LIANGYan-Jun,ZHAOGuo-Ping,LIYing,HUYi-Lan,LIHui,WEIMao-Ti.ResearchInstituteofNephrology,DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China

[Abstract]Objective:To explore the associations of MYH9 gene polymorphisms with ESRD in Han population in the fragment between exon 23 and 24.Methods: A hospital-based case control study was carried out including 180 patients and 118 controls in this study.Single nucleotide polymorphisms of MYH9 gene were determined using PCR sequencing,and the haplotypes were calculated using phase software(version 2.0),and transcription factor binding sites were predicted using AliBaba2.Univariate analysis was conducted for exploring the associations between polymorphisms and ESRD.Results: Five newly discovered and three previously reported SNP loci[Rs4821480(MYH9-92),Rs2032487(MYH9-273) and Rs4821481(MYH9-787)]were homozygote genotyped by bidirectional sequencing.Among newly discovered polymorphisms,two were found at the 489 locus(G→A)and the 616 locus(A→C) in the 901 bp fragment which located in the intron 23 of MYH9 gene.A G489A transversion was very likely a risk mutation contribute to the occurrence of ESRD(P=0.013).No association was observed between ESRD and three previous reported sites [Rs4821480(MYH9-92),Rs2032487(MYH9-273)and Rs4821481(MYH9-787)].The most common haplotype was TCTCGGAT,which was less frequent in the cases than that in the controls.Moreover,TCTCGGCT and TCTCAGAT haplotypes were more in the cases than that in the controls.The number of transcription binding sites increased from 82(wild)to 85(mutation)in the 23th intron of MYH9 gene.Conclusion: Polymorphisms of MYH9 at intron 23 may influence the prevalence of ESRD in Chinese Han population and TCTCGGAT haplotype may be one protective haplotype.TCTCGGCT and TCTCAGAT may be risk haplotypes attributed to ESRD.The polymorphism of MYH9 at the 23th intron may company with the amount alteration of transcription factor binding sites.

[Key words]End-stage renal disease(ESRD);The non-muscle myosinⅡA gene(MYH9);Han population

作者簡介：石理華(1972年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腎臟病學(xué)研究，E-mail：shilihua1972@163.com。

通訊作者④，武警后勤學(xué)院部隊流行病學(xué)與統(tǒng)計學(xué)教研室，天津300309。

中圖分類號R692

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0079-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.017