高　軒　陳荔枝　劉振紅　呂艷華　夏立偉　李永秋

(唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，唐山063000)

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白藜蘆醇通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷

高軒陳荔枝①劉振紅①呂艷華①夏立偉李永秋

(唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，唐山063000)

[摘要]目的：探討白藜蘆醇(Resveratrol,Res)對大鼠腦缺血/再灌注誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用。方法：將72只健康雄性SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法分為3組(n=24)：假手術(shù)組(S組)、腦缺血/再灌注模型組(I/R組)、Res組(R組)。采用阻斷左側(cè)大腦中動脈并阻斷雙側(cè)頸總動脈30 min恢復(fù)灌注的方法制備大鼠腦缺血/再灌注模型。R組于缺血前7 d給予腹腔注射Res(50 mg/kg)，1次/日。對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分后留取腦組織，采用TTC法檢測腦梗死體積，干濕重法測定腦組織含水量，免疫組織化學及Western blot法檢測大腦皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、CHOP的表達變化。結(jié)果：與S組比較，I/R組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量升高(P<0.05)，腦梗死體積增大(P<0.05)，皮層GRP78、p-PERK和CHOP蛋白表達均顯著上調(diào)(P<0.05)。與I/R組比較，P組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量降低(P<0.05)，腦梗死體積減小(P<0.05)，GRP78表達上調(diào)(P<0.05)，p-PERK和CHOP蛋白表達下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：白藜蘆醇通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，對大鼠腦缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護作用。

腦缺血/再灌注(Cerebral ischemia /reperfusion,I/R)損傷的病理生理過程十分復(fù)雜，主要包括細胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、興奮性氨基酸釋放增加、細胞酸中毒、自由基生成等，這些環(huán)節(jié)最終導致神經(jīng)細胞凋亡和壞死[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是腦缺血/再灌注損傷中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可啟動神經(jīng)細胞凋亡途徑[2]。葡萄糖調(diào)控蛋白78(Glucose regulated protein,GRP78)，磷酸化胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(pancreatic ER kinase,p-PERK)，C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志性蛋白，其中GRP78上調(diào)可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白負荷，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被過度誘導時，就會啟動PERK/CHOP途徑，導致細胞死亡。白藜蘆醇是多種植物內(nèi)的一種多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基和抑制凋亡等作用，同時在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]，但其確切機制尚不清楚。本研究擬探討白藜蘆醇的腦保護作用是否與抑制腦缺血/再灌注損傷誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，為明確其機制提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要藥物和試劑白藜蘆醇購自Sigma公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Amresco公司；兔抗大鼠的GRP78、p-PERK、CHOP及β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔IgG即用型SABC免疫組化試劑盒購自博士德生物工程有限公司；BCA試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2實驗動物與分組SPF級成年SD大鼠72只，雄性，體重350～400 g，3月齡左右，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。采用隨機數(shù)字表法，將所有大鼠隨機分為三組：假手術(shù)組(S組)、腦缺血/再灌注模型組(I/R組)、Res組(R組)，每組24只。每組又分為4個時間點，每個時間點6只大鼠。

1.2方法

1.2.1動物模型制備及處理參照文獻[4]步驟，阻斷左側(cè)大腦中動脈并阻斷雙側(cè)頸總動脈30 min恢復(fù)灌注的方法制備大鼠腦缺血/再灌注損傷模型。腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，取仰臥位行頸部正中切口，分離暴露雙側(cè)頸總動脈。然后取右側(cè)臥位，分離暴露左側(cè)大腦中動脈，用電凝器電凝嗅束近端至大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈。再次仰臥位，無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，缺血30 min后松開動脈夾恢復(fù)灌注。Sham組僅分離暴露雙側(cè)頸總動脈與左側(cè)大腦中動脈，但不夾閉不電凝。Res組于模型制備前7 d給予白藜蘆醇無菌液腹腔注射(50 mg/kg)，1次/日，連續(xù)注射7 d，最后一次注射在造模前1 h。

1.2.2神經(jīng)功能缺損評分于再灌注24 h時，參照文獻[5]對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。無神經(jīng)功能缺損癥狀計為0分；垂直提起時缺血對側(cè)前肢不能伸展計為1分，行走時向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈計為2分，行走時向缺血對側(cè)傾倒計為3分，意識消失不能自發(fā)行走計為4分。

1.2.3腦含水量測定采用干濕重法測定大鼠腦組織含水量，取出缺血側(cè)大鼠腦組織迅速稱其濕重，然后置于105℃高溫烤箱內(nèi)，干燥48 h后稱量其干重。腦組織腦含水量按Elliott公式計算：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重× 100%。

1.2.4腦梗死體積測定神經(jīng)功能缺陷評分測定完畢后，采用TTC染色法測量腦梗死體積。麻醉后迅速斷頭后取腦組織，由前向后冠狀面切片，置入新鮮配制的2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃恒溫烤箱避光染色30 min后，置入4%多聚甲醛溶液固定保存。紅色為正常腦組織，白色為梗死灶。分離紅色和白色腦組織，分別稱重，計算腦梗死體積：腦梗死體積(%)=蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)×100%。

1.2.5免疫組織化學法檢測大鼠心臟快速灌注生理鹽水約200 ml，隨后4%多聚甲醛約300 ml，斷頭取腦固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋，冠狀切片(5 μm)。微波修復(fù)1 min，3% H2O2滅活15 min，5% BSA封閉30 min，甩干后滴加兔抗大鼠GRP78、CHOP多克隆抗體，抗體效價分別為1∶100和1∶50，4℃過夜。次日滴加羊抗兔的辣根過氧化物酶標記的IgG，孵育30 min，SABC液孵育40 min，DAB顯色5 min。終止反應(yīng)后脫水、透明、中性樹膠封片，置于鏡下觀察。

1.2.6Western blot法檢測 取大鼠腦組織80 mg，加入1 ml RIPA裂解液，超聲裂解，低溫離心后取上清液。BCA法進行蛋白定量，配置5%的濃縮膠和10%的分離膠，50 μg蛋白上樣進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干法轉(zhuǎn)至PVD F膜上，5% BSA封閉1 h，滴加兔抗大鼠GRP78、p-PERK、CHOP和β-actin多克隆抗體，抗體效價均為1∶500，4℃過夜。次日滴加羊抗兔的IgG，室溫孵育1 h，ECL顯色曝光。Image J醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，以目標蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值反應(yīng)目標蛋白表達水平。

2結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果大鼠取材前進行神經(jīng)功能缺損的評定，評定結(jié)果顯示：Sham組大鼠無神經(jīng)缺損的各種癥狀；與Sham組比較，I/R組大鼠的神經(jīng)功能缺陷評分較高(P<0.05)；Res組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分較I/R組降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠腦組織含水量改變干濕重法測定大鼠腦組織含水量改變，評價大鼠腦水腫程度。與Sham組比較，I/R組大鼠腦組織含水量增加(P<0.05)；與I/R組比較，Res組大鼠腦組織含水量減少(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠腦梗死體積變化 TTC染色法測量大鼠腦梗體積變化，結(jié)果顯示：Sham組大鼠未見腦梗死區(qū)域；與Sham組相比，I/R組大鼠腦梗死體積增大(P<0.05)；Res組大鼠較I/R組腦梗死體積相比明顯縮小(P<0.05)。見表1。

2.4GRP78的免疫組織化學染色結(jié)果GRP78陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于細胞漿中。Sham組大鼠皮層可見GRP78微量基礎(chǔ)表達，免疫反應(yīng)較弱；I/R組大鼠皮層GRP78呈強陽性表達，廣泛分布于大腦皮層，陽性細胞數(shù)較多，免疫反應(yīng)性較強；Res組大鼠皮層GRP78陽性細胞數(shù)增多，免疫反應(yīng)性進一步增強。見圖1。

2.5CHOP的免疫組織化學染色結(jié)果CHOP陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于胞核，也可見于胞漿中。Sham組大鼠皮層可見CHOP微量表達；I/R組大鼠皮層CHOP呈強陽性表達，陽性細胞數(shù)目較多，免疫反應(yīng)性較強；Res組大鼠皮層CHOP陽性細胞數(shù)目減少，且免疫反應(yīng)性減弱。見圖2。

表1大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量變化

Tab.1Changes of neurological deficit score,cerebral infarct size,brain water content in each group

GroupsNeurologicaldeficitscoreCerebralinfarctsize(%)Brainwatercontent(%)Shamgroup0075.34±3.29I/Rgroup2.98±0.671)42.65±2.821)87.66±2.581)Resgroup1.18±0.232)18.46±1.512)78.22±3.052)

Note：1)P<0.05,compared with Sham group;2)P<0.05,compared with I/R group.

圖1　腦皮層GRP78免疫組織化學染色結(jié)果(×400)Fig.1　Immunohistochemical stainning of GRP78 in cortex(× 400)Note: A.Sham group;B.I/R group;C.Res group.

2.6GRP78蛋白定量結(jié)果Sham組大鼠皮層GRP78呈現(xiàn)弱表達；I/R組大鼠皮層GRP78蛋白表達量較Sham組明顯增多(P<0.05)，于3 h開始升高，6 h達高峰，隨后開始回落；與I/R組對應(yīng)時間點相比，Res組大鼠皮層GRP78的蛋白表達量明顯升高(P<0.05)。見圖3。

2.7p-PERK和CHOP蛋白定量結(jié)果Sham組大鼠皮層p-PERK和CHOP呈現(xiàn)微量表達；與Sham組相比，I/R組大鼠皮層p-PERK和CHOP蛋白表達量明顯上調(diào)(P<0.05)，于6 h開始升高，12 h達高峰，隨后降低；與I/R組對應(yīng)時間點相比，Res組大鼠皮層p-PERK和CHOP蛋白表達量明顯下調(diào)(P<0.05)。見圖4、5。

圖2　腦皮層CHOP免疫組織化學染色結(jié)果(×400)Fig.2　Immunohistochemical stainning of CHOP in cortex(× 400)Note: A.Sham group;B.I/R group;C.Res group.

圖3　腦皮層GRP78蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.3　Western blot result of GRP78 expression in cortexNote: a.Sham group;b.I/R group;c.Res group.*.P<0.05,compared with Sham group;#.P<0.05,compared with I/R group.

圖4　腦皮層p-PERK蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.4　Western blot result of p-PERK expression in cortexNote: a.Sham group;b.I/R group;c.Res group.*.P<0.05,compared with Sham group;#.P<0.05,compared with I/R group.

圖5　腦皮層CHOP蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.5　Western blot result of CHOP expression in cortexNote: a.Sham group;b.I/R group;c.Res group.*.P<0.05,compared with Sham group;#.P<0.05,compared with I/R group.

3討論

本研究通過阻斷左側(cè)大腦中動脈并阻斷雙側(cè)頸總動脈方法制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，并于缺血前7 d給予白藜蘆醇腹腔注射，采用行為學、形態(tài)學及分子生物學方法觀察白藜蘆醇對腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用及機制。結(jié)果表明白藜蘆醇預(yù)處理可降低神經(jīng)功能缺損評分改善神經(jīng)功能；可縮小腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積；減少腦組織含水量緩解腦水腫，揭示白藜蘆醇在大鼠腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮保護性療效，提示其可能具有較好的臨床應(yīng)用前景。然而，目前白藜蘆醇神經(jīng)保護作用的機制尚未闡明。有文獻報道白藜蘆醇通過抑制NF-κB信號通路下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶功能，進而阻斷其介導的胞外基質(zhì)降解，減輕大鼠海馬結(jié)構(gòu)與功能損傷[6]。其次還可通過上調(diào)神經(jīng)保護因子沉默信息調(diào)控因子1(Sirtuins 1，Sirtl)的表達，進而促進自噬的激活，減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷[7]。另外多數(shù)研究顯示白藜蘆醇可減輕缺血半暗帶內(nèi)及海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡，其作用機制與上調(diào)Bcl-2的表達，激活PI3K/AKT通路抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達相關(guān)[8,9]。鑒于白藜蘆醇抗凋亡的生物學作用，以及腦缺血/再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是啟動凋亡的一種新途徑，本研究將進一步探討白藜蘆醇對腦缺血/再灌注損傷的保護作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等各種刺激導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白質(zhì)的聚集，使細胞生理功能發(fā)生紊亂的一種狀態(tài)[10]。ERS是細胞的一種自我保護機制，適度ERS的激活可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的恢復(fù)，持續(xù)而強烈的ERS可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑介導的細胞凋亡，造成組織損傷[11]。葡萄糖調(diào)控蛋白78(Glucose regulated protein,GRP78)，磷酸化胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(pancreatic ER kinase,p-PERK)，C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志性蛋白。其中GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子伴侶蛋白，其高表達可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白聚集，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷[12]。本實驗的免疫組化及免疫印跡結(jié)果顯示I/R大鼠大腦皮層中GRP78的表達明顯上調(diào)，于6 h達高峰?？赡苡捎谌毖獏^(qū)出現(xiàn)低血低氧低糖，導致錯誤折疊蛋白聚集誘發(fā)ERS，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能，大鼠皮層細胞高表達GRP78可部分緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。白藜蘆醇注射可進一步增強大鼠皮層GRP78蛋白的表達量，進一步促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)。同時我們還發(fā)現(xiàn)I/R大鼠皮層中p-PERK和CHOP蛋白也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，于12 h 達高峰，二者為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相關(guān)促凋亡蛋白。由此推理腦缺血/再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被持續(xù)而強烈的誘導后細胞啟動PERK/CHOP途徑，最終導致細胞凋亡。并且有報道顯示GRP78具有抗凋亡的作用，阻止caspases級聯(lián)反應(yīng)[13]。白藜蘆醇預(yù)處理可明顯下調(diào)皮層p-PERK和CHOP的蛋白表達，進而減輕細胞損傷。

綜上所述，腦缺血/再灌注后GRP78、p-PERK和CHOP高表達，表明細胞啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。一方面高表達的GRP78蛋白可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷修復(fù)，另一方面高表達的p-PERK和CHOP可啟動細胞損傷途徑。白藜蘆醇預(yù)處理可進一步上調(diào)GRP78蛋白的表達，而下調(diào)p-PERK和CHOP蛋白的表達，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，減輕細胞損傷。本研究揭示了白藜蘆醇在腦缺血/再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用機制，為腦缺血/再灌注的預(yù)防及臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

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[收稿2015-07-08修回2015-08-21]

(編輯許四平)

[關(guān)鍵詞]白藜蘆醇；腦缺血；再灌注損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；應(yīng)激

Resveratrol ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress in rats

GAOXuan,CHENLi-Zhi,LIUZhen-Hong,LüYan-Hua,XIALi-Wei,LIYong-Qiu.DepartmentofNeurology，TangshanWorkers′Hospital，Tangshan063000，China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of resveratrol(Res)on endoplasmic reticulum stress induced by cerebral ischemia/reperfusion(I/R)injury in rats.Methods: The seventy-two male SD rats were divided randomly into three groups(n=20)：sham operation group(group S),I/R group and Res-treatment group(group R).Focal cerebral I/R model was induced by electrocoagulation of left middle cerebral artery and occlusion of bilateral common carotid arteries followed by reperfusion after 30 min.The rats in Res group were treated with Res(50 mg/kg)i.p.7 d before the operation,once a day for 7 d.Neurological deficits were assessed at 24 h post-injury,followed by collecting the brain tissues.Cerebral infarct size was detected by TTC staining,and the water content of brain tissue were measured by wet-dry weight method.The expression of GRP78，p-PERK and CHOP proteins were deter-mined by immunohistochemistry and Western blot analysis.Results: Compared with sham group,the neurological deficit score and the brain water content were significantly increased(P<0.05),cerebral infarct size was enlarged(P<0.05),and the expression of GRP78，p-PERK and CHOP were up-regulated in I/R group(P<0.05).At the corresponding time,compared with I/R group,the neurological deficit score and the brain water content were markedly decreased(P<0.05)，cerebral infarct size was smaller(P<0.05),the level of GRP78 was notablely increased(P<0.05),while the expression of p-PERK and CHOP were down-regulated in Res group(P<0.05).Conclusion: Resveratrol plays a protection role in ischemia-reperfusion injury,through inhibiting the endoplasmic reticulum stress in rats.

[Key words]Resveratrol;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Endoplasmic reticulum;Stress

作者簡介：高軒(1974年-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腦缺血/再灌注損傷機制及治療的研究，E-mail:gaoxuan1972@yeah.net。

中圖分類號R743.35
①唐山市工人醫(yī)院社區(qū)醫(yī)療部，唐山063000。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0092-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.020