徐筱婧，瞿　浩，張　華△

(貴州省人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；神經(jīng)內(nèi)科，貴州貴陽 550002)

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·論著·

基因芯片法檢測(cè)體檢人群ALDH2基因多態(tài)性＊

徐筱婧1，瞿浩2，張華1△

(貴州省人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；神經(jīng)內(nèi)科，貴州貴陽 550002)

摘要:目的采用基因芯片法檢測(cè)體檢人群ALDH2基因，評(píng)價(jià)該方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)的可行性。方法檢測(cè)對(duì)象為100例體檢人員，采用基因芯片檢測(cè)法，檢測(cè)ALDH2基因第487突變位點(diǎn)3個(gè)不同的基因分型：GG型、GA型、AA型。結(jié)果共檢出GG型72例，GA型26例，AA型2例。結(jié)論基因芯片檢測(cè)法可滿足臨床ALDH2基因檢測(cè)的要求，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:ALDH2基因；芯片檢測(cè)

人乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)是一種位于12號(hào)染色體編碼基因呈高度多態(tài)性的四聯(lián)體蛋白，為酒精代謝的關(guān)鍵酶[1]，芯片檢測(cè)法是近年來興起的一項(xiàng)基因檢測(cè)技術(shù)，為探討該方法臨床應(yīng)用可行性，筆者對(duì)100例體檢樣本進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2010年11月至2011年9月期間本院體檢人員，共100例。其中男79例，女21例，年齡20～66歲，平均(42.29±7.52)歲,遵循受檢者知情自愿原則。

1.2儀器與試劑上海百傲公司雜交儀、掃描儀；上海百傲科技公司ALDH2基因檢測(cè)試劑盒、ALDH2基因檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)；天根生化科技有限公司全血基因組DNA提取試劑盒；北京博奧科技公司DNA定量?jī)x、普通PCR擴(kuò)增儀。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理采集外周靜脈血2 mL(EDTA抗凝)，用上海百傲科技有限公司血液基因組DNA提取系統(tǒng)(離心柱型)試劑盒，提取全血DNA。

1.3.2基因組DNA電泳分析2%瓊脂糖凝膠，6×Loading buffer 1 μL與5 μL DNA樣本混勻后點(diǎn)樣，5 μL Marker點(diǎn)樣，100 V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果見圖2。

1.3.3PCR反應(yīng)按試劑盒說明書準(zhǔn)備反應(yīng)體系，見表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，35 cycles;72 ℃ 5 min。

1.3.4PCR產(chǎn)物電泳分析2%瓊脂糖凝膠，6×Loading buffer 1 μL與5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后點(diǎn)樣，5 μL Marker點(diǎn)樣，100 V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果見圖3。

表1　　PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.3.5雜交按上海百傲基因檢測(cè)試劑盒說明書配備雜交體系進(jìn)行雜交，雜交程序設(shè)置見表2，雜交總時(shí)間約為1 h 40 min。

1.3.6芯片掃描及判讀雜交完畢，用上海百傲基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描，ALDH2判讀系統(tǒng)進(jìn)行基因型判讀。芯片點(diǎn)陣見圖1(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站“論文附件”)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2結(jié)果

2.1基因組DNA電泳結(jié)果如圖2所示:提取的基因組DNA位于點(diǎn)樣孔附近，條帶完整、清晰、明亮，DNA質(zhì)量好，1～5泳道均為樣本基因組DNA，見圖2(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站“論文附件”)。

2.2PCR電泳結(jié)果ALDH2基因片段大小為438 bp，目標(biāo)片段在250～500 bp之間，與目的片段大小吻合。1～5泳道均為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。見圖3(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站“論文附件”)。

表2　　雜交程序

2.3100例樣本各基因型比例100例檢測(cè)樣本中，共檢測(cè)出野生純合型(GG型)72例；雜合突變型(GA型)26例；突變純合型(AA型)2例。100例樣本中各基因型所占比例分布見表3。

表3　　100例體檢樣本各基因型比例

2.4ALDH2基因芯片檢測(cè)結(jié)果為驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，取部分樣本進(jìn)行測(cè)序，ALDH2各基因型芯片掃描圖及對(duì)應(yīng)測(cè)序圖，芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合見圖4～6(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站“論文附件”)。

3討論

人類ALDH2基因上共發(fā)現(xiàn)了84個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中在外顯子12處發(fā)生點(diǎn)突變(Glu487Lys)，谷氨酸Glu(密碼子GAA)變?yōu)橘嚢彼酟ys(密碼子AAA)，使正常的等位基因G，變?yōu)橥蛔冃偷任换駻，導(dǎo)致該基因編碼的酶的催化能力下降[2]。因遺傳，在人群中該酶基因型出現(xiàn)3種情況，具有正常催化活性的純合子型：GG型；催化活性下降的雜合子型：GA型；催化活性失去的純合子型：AA型。乙醛脫氫酶是酒精代謝的關(guān)鍵酶。在肝臟內(nèi)，乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化乙醇脫氫生成乙醛，乙醛進(jìn)一步在 ALDH的催化下脫氫生成己酸，再經(jīng)三羧酸循環(huán)途徑氧化生成二氧化碳和水排出體外[3]?；蛐虶A和AA者，因不具有ALDH酶活性或酶活性下降,飲酒后可使乙醛氧化為乙酸延遲。乙醛損傷肝細(xì)胞可引起纖維變性，影響能量代謝并產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致酒精中毒性肝炎、脂肪肝、纖維變性及肝硬化等。ALDH2基因的作用除與酒精代謝相關(guān)外，另發(fā)現(xiàn)其與人類各系統(tǒng)及其他疾病間也密切相關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)道ALDH2 是硝酸甘油(GTN)的有效代謝物一氧化氮 (NO)形成的關(guān)鍵[4]。試驗(yàn)表明,ALDH2基因在硝酸甘油對(duì)肺部及循環(huán)系統(tǒng)血管床的生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[5]，如果患者基因中攜帶有 ALDH2基因(Glu487Lys)突變,可使硝酸甘油在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程受阻,藥物難以有效發(fā)揮作用[6]。

另外，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，ALDH2是不依賴乙醇的心血管疾病的獨(dú)立影響因素，可通過減少活性氧簇(ROS)或解毒4-HNE途徑抑制乙醛或缺氧而至的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心功能不全和心肌病起到保護(hù)作用[7]。ALDH2缺陷型是冠心病的危險(xiǎn)因素[8]，ALDH2野生型伴隨著更高的高血壓風(fēng)險(xiǎn)[9]。由此可見，ALDH2基因突變對(duì)多系統(tǒng)多類型疾病存在不良影響，ALDH2基因型檢測(cè)，可了解是否為突變基因攜帶，對(duì)各系統(tǒng)疾病均具有重要的臨床指導(dǎo)意義。有利于對(duì)心血管病高危人群進(jìn)行宣教，進(jìn)行早期預(yù)防及干預(yù)；可指導(dǎo)硝酸甘油臨床用藥；以及在篩選酒精易感人群并采取有效的保護(hù)和干預(yù)措施等方面都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究共檢測(cè)樣本100例，測(cè)出野生純合型(GG型)72例；雜合突變型(GA型)26例；突變純合型(AA型)2例。結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，江春曉等[10]曾檢測(cè)231例樣本，測(cè)出野生型145例,突變型86例；曹西蓉等[11]檢測(cè)60例，測(cè)出(GG型)37例，(GA型)21例，(AA型)2例，提示ALDH2基因存在較高的突變率。

基因檢測(cè)方法多樣，目前線粒體ALDH2基因多態(tài)性檢測(cè)方法主要有：PCR產(chǎn)物限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)和直接測(cè)序法。PCR-RFLP法的缺點(diǎn)是測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、PCR反應(yīng)產(chǎn)生的氣溶膠極易對(duì)其他標(biāo)本產(chǎn)生污染、不能進(jìn)行自動(dòng)化的分析、結(jié)果的判讀受到人為因素的影響等。測(cè)序法需要特殊的儀器和專門的操作人員，不適合在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[12]。本研究采用芯片檢測(cè)法，該方法由DNA提取、雜交儀雜交、芯片掃描幾個(gè)步驟組成,有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)各試劑在雜交儀內(nèi)自動(dòng)完成雜交、洗滌，一份標(biāo)本一張芯片，避免了人工操作的污染，并且有效節(jié)省工作時(shí)間；(2)掃描儀自動(dòng)分析圖像，避免了人為判斷的誤差，相較傳統(tǒng)方法較高效準(zhǔn)確；(3)基因組DNA及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析證實(shí)為ALDH2基因，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，證實(shí)芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合，表明芯片檢測(cè)結(jié)果可信；(4)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，易于實(shí)驗(yàn)人員掌握；(5)相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，芯片法的出現(xiàn)表明現(xiàn)代化檢測(cè)技術(shù)在不斷優(yōu)化成熟。綜上所述，表明芯片檢測(cè)法快捷、高效、準(zhǔn)確、先進(jìn)，能滿足臨床對(duì)ALDH2基因檢測(cè)的需求，是值得臨床推廣的一項(xiàng)新興基因檢測(cè)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)的不足之處：本研究方法屬于臨床實(shí)驗(yàn)性研究，樣本量尚小，且限制在體檢人群，下一步擬將擴(kuò)大樣本量，納入臨床各系統(tǒng)疾病患者，進(jìn)一步觀察ALDH2基因多態(tài)性芯片檢測(cè)法在臨床多系統(tǒng)疾病方面的指導(dǎo)意義。

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Gene chip method for detecting ALDH2 gene polymorphism among populations of healthy physical examination*

XuXiaojing1,QuHao2,ZhangHua1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofNeurology,GuizhouProvincial

People′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China)

Abstract:ObjectiveTo adopt the gene chip method to detect the ALDH2 gene polymorphism for evaluating the feasibility of this method used in clinical detection.Methods100 individuals undergoing the healthy physical examination were selected as the detection objects.The gene chip method was adopted to detect the genotype GG,GA and AA in 487 mutation loci of ALDH2 gene.Results72 cases of GG type,26 cases of GA and 2 cases of AA were detected out.ConclusionThe gene chip method could meet the requirements of clinical ALDH2 gene detection with better clinical application prospect.

Key words:aldehyde dehydrogenase 2 gene;gene chip

(收稿日期：2015-07-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.005

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)01-0011-03

*基金項(xiàng)目：貴州省科技廳社發(fā)與科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合LS字[2011]011號(hào))。

作者簡(jiǎn)介：徐筱婧，女，初級(jí)檢驗(yàn)技師，主要從事分子生物學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：780837482@qq.com。