田　莉， 謝　莉， 張慧慧， 高曉黎

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院; 2新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室; 3新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊　830011)

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基于Caco-2細胞單層模型研究鞣花酸的轉(zhuǎn)運特性

田莉1,2， 謝莉1， 張慧慧1， 高曉黎3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院;2新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室;3新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011)

摘要：目的研究鞣花酸在Caco-2細胞單層模型上的轉(zhuǎn)運特性。方法利用MTT法確定鞣花酸單體在Caco-2細胞單層模型轉(zhuǎn)運過程的安全濃度區(qū)間。以鞣花酸的表觀滲透系數(shù)(Papp)和累積轉(zhuǎn)運量為衡量指標，采用高效液相色譜法(HPLC)測定鞣花酸含量，考察不同濃度、不同孵育時間的鞣花酸在Caco-2細胞單層模型上的雙向轉(zhuǎn)運過程。結(jié)果鞣花酸的累計轉(zhuǎn)運量與孵育時間、給藥濃度呈正相關(guān)，不同濃度的鞣花酸Papp值差異明顯且吸收作用明顯強于外排作用，外排比均<1.5。結(jié)論鞣花酸單體在Caco-2細胞模型的雙向轉(zhuǎn)運過程中以主動轉(zhuǎn)運為主，外排蛋白可能未參與轉(zhuǎn)運過程，鞣花酸為難吸收的一類藥物。

關(guān)鍵詞：Caco-2細胞單層模型； 鞣花酸； HPLC； 轉(zhuǎn)運

鞣花酸屬于沒食子酸的二聚體衍生物，是石榴皮中多酚類物質(zhì)的主要成分之一，約占石榴皮多酚精制物的20.4%[1]。研究表明，鞣花酸具有抗癌變、抗菌、抗病毒、抗氧化等多種生理和藥理活性作用，在食品、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2-3]。

目前有關(guān)鞣花酸的吸收機制未見報道。Caco-2細胞模型已廣泛用于預(yù)測藥物小腸吸收和轉(zhuǎn)運機制的研究[4]。本研究采用Caco-2細胞模型考察鞣花酸的轉(zhuǎn)運特性，以期為石榴皮多酚和鞣花酸口服劑型設(shè)計和臨床應(yīng)用提供藥動學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1細胞株Caco-2細胞株購自于武漢博士德生物工程有限公司(批號：CX0064)。

1.2藥品及試劑Angilent高效液相色譜儀LC-6AD 、CBM-20A色譜工作站、SPD-20A 型紫外檢測器、SIL-20A 型自動進樣器、DKZ系列恒溫振蕩浴槽(上海恒科學(xué)儀器有限公司)，CO-150 型二氧化碳孵箱 (美國NBS公司)，XS105型電子天平(德國，梅特勒-托利多)，TDL-40B高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BA210型光學(xué)顯微鏡(Motic公司)，SPECTRAMAX 190酶標儀(美國，Molecu1ar Devices公司)，BCA蛋白分析試劑盒(Pierce，美國)，12孔Transwell 細胞轉(zhuǎn)運培養(yǎng)小室(美國Corning公司，0.4 μm Pore Size，批號：13413031)。鞣花酸對照品(成都曼思特生物科技有限公司；生產(chǎn)批號：R-004-140731)，DMEM培養(yǎng)基(高糖型，美國Hyclone公司，批號: 1439934)，胎牛血清( 美國Gibico公司，Lot:1439934)，非必需氨基酸(美國Hyclone公司，批號:AYM175938)，L-谷氨酰胺(美國Hyclone公司，批號:08H07A12)，青霉素-鏈霉素雙抗液(美國Hyclone 公司，批號: J130031)，胰蛋白酶(含 0.02% EDTA ，美國Hyclone公司，批號: J140003)，HBSS平衡鹽溶液(美國Hyclone公司，批號: 03C06A75)，PBS磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司，批號:NAF14010)，二甲基亞砜(DMSO，華美生物公司)，二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT，美國Amresco公司)，甲醇(Fisher Scientific；色譜純)，屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的配制精密稱取鞣花酸5.4 mg，置于5 mL 容量瓶中，加入DMSO溶解，定容，即得1.080 mg/mL鞣花酸儲備液，冷藏，備用。

2.2色譜條件YMC-Triart C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶0.4%磷酸(55∶45)，柱溫35℃；檢測波長254 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

2.3樣品處理轉(zhuǎn)運試驗結(jié)束后，樣品迅速12 000 r/min離心10 min，取上清液置-20℃保存。

2.4專屬性按“2.2”項下的色譜條件，分別對空白HBSS轉(zhuǎn)運液、空白轉(zhuǎn)運液+鞣花酸對照品、鞣花酸轉(zhuǎn)運樣品進行HPLC分析，鞣花酸對照品的保留時間與轉(zhuǎn)運樣品的保留時間一致，空白轉(zhuǎn)運液無干擾，見圖1。

A：空白HBSS轉(zhuǎn)運液

B：鞣花酸對照品

C：鞣花酸轉(zhuǎn)運樣品

圖1鞣花酸的HPLC色譜圖

2.5線性關(guān)系考察將“2.1”項下方法制備的鞣花酸儲備液用HBSS溶液稀釋成25 μg/mL的工作液，過濾，分別吸取0.5、1、2、4、6、8、10、20 μL進樣測定，以鞣花酸峰面積(A)對進樣量(X)進行線性回歸，得回歸方程為A=1 987 496.98X+5 034.48 (r=0.999 8)，表明鞣花酸進樣量在0.025 4~1.016 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗按“2.1”項下方法制備的鞣花酸儲備液，用空白轉(zhuǎn)運液分別制備低(6.13 μg/mL)、中(12.25 μg/mL)、高(25 μg/mL)3個濃度的樣品，按“2.2”項下色譜條件測定，重復(fù)進樣6次，結(jié)果低、中、高濃度測定的峰面積的RSD值分別為3.02%、2.05%、1.87%，表明該方法精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗分別取低(6.13 μg/mL)、中(12.25 μg/mL)、高(25 μg/mL)3個濃度的鞣花酸樣品，考察樣品于37℃下放置3 h的穩(wěn)定性、樣品于室溫下放置4 h的穩(wěn)定性及樣品于-20℃下放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明樣品于37℃下放置3 h可保持穩(wěn)定，樣品于室溫下放置4 h內(nèi)保持穩(wěn)定，于-20℃條件下放置2 w保持穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗分別取低(6.13 μg/mL)、中(12.25 μg/mL)、高(25 μg/mL)3個濃度的鞣花酸樣品作為本底值，將 50.00 μg/mL的鞣花酸對照品溶液作為加入量。按“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，鞣花酸低、中、高濃度的加樣回收率分別為88.97%、95.68%、101.45%，表明該方法具有較好的準確度。

2.9Caco-2單層模型的建立與評價[5]以DMEM高糖培養(yǎng)基為培養(yǎng)液(其中含10%FBS、1%非必需氨基酸、1%雙抗)，置于培養(yǎng)瓶中，隔天換液，待細胞長至80%時以1∶3進行傳代，傳2代后，將細胞以2×105個/孔接種于12孔Transwell 小室中，第1 周隔天換液，1 w后每天換液，連續(xù)培養(yǎng)至21 d。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)可見細胞連接緊密(圖2)，測定細胞電阻值的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14 d后電阻> 600 Ω/cm2，且越往后電阻值增長越慢，表明Caco-2細胞單層模型建成，細胞有較好的緊密性和完整性，可進行轉(zhuǎn)運試驗，見圖3。

圖2　Caco-2細胞培養(yǎng)至21 d的細胞形態(tài)圖

圖3　細胞跨膜電阻值隨時間變化圖(n=3， ±s)

2.10MTT法確定鞣花酸的安全濃度范圍將細胞以4×104個/mL孔接種于96孔培養(yǎng)板，置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育24 h，用HBSS溶液清洗細胞2次后，分別加入HBSS溶液稀釋后的鞣花酸不同濃度工作液(50、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL)為實驗組，加入HBSS溶液的為空白組，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，分別加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)的MTT試劑，分別另加150 μL DMSO，37℃恒溫振蕩10 min，充分溶解藍紫色結(jié)晶。在酶標儀中490 nm處測定吸光度(A)，計算細胞存活率：細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)。結(jié)果表明，不同濃度鞣花酸組間無顯著差異，各濃度梯度對Caco-2細胞的抑制不明顯，細胞存活率均>80%，可確定在1.25~50μg/mL濃度范圍內(nèi)為安全濃度，可進行Caco-2細胞雙向轉(zhuǎn)運試驗。

C/(μg/mL)Papp/(cm/s)AP-BLBL-APERB-A/A-B103.57±0.031.54±0.140.43206.59±0.032.74±0.140.42408.68±0.244.27±0.080.49

3討論

Caco-2細胞來源于人類的結(jié)腸腺癌細胞，具有與人體小腸上皮細胞相類似的結(jié)構(gòu)和功能，生長到一定程度時可分化出微絨毛且連接緊密，不僅能分泌出類似于小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，而且在一定程度上可表達相關(guān)的蛋白，能在細胞水平上提供有關(guān)藥物吸收轉(zhuǎn)運的的信息[4,7]。Caco-2細胞培養(yǎng)過程操作要求較高，但仍不失為一種藥物吸收研究的快速、可靠的篩選工具，并已被美國FDA批準為藥物吸收篩選模型用于藥物體外吸收機制及藥物相互作用等方面的研究[7]。

本實驗利用 Caco-2細胞單層細胞模型研究鞣花酸的雙向轉(zhuǎn)運特性，以細胞毒性試驗MTT比色法對Caco-2細胞進行存活和生長檢測，受損傷的活細胞線粒體中存在琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原成藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，該法操作簡便、重復(fù)性好。鞣花酸MTT試驗表明，Caco-2細胞在給藥培養(yǎng)4 h后，鞣花酸低濃度對細胞具有輕微促進作用，高濃度具有輕微抑制作用，但濃度在1.25~50μg/mL范圍內(nèi)，細胞的存活率均> 80%，說明此濃度范圍為細胞給藥的安全濃度。在雙向轉(zhuǎn)運過程中，鞣花酸的累積攝取量隨轉(zhuǎn)運時間和轉(zhuǎn)運濃度的增加而增加，表觀滲透系數(shù)Papp(AP-BL)明顯高于Papp(BL-AP)，且外排比均<1.5，說明鞣花酸的吸收主要以主動轉(zhuǎn)運為主，轉(zhuǎn)運過程中需要載體和消耗能量，外排蛋白可能對整個轉(zhuǎn)運過程影響不大。

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(本文編輯施洋)

Transport characteristics of ellagic acid across Caco-2 cell monolayer model

TIAN Li1,2，XIE Li1，ZHANG Huihui1, GAO Xiaoli3

(1CollegeofTCM,XinjiangMedicalUniversity;2XinjiangKeyLaboratoryofFamousPrescription

andScienceofFormula；3CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo study the transport behavior of ellagic acid in Caco-2 cell monolayer model. MethodsMTT method was employed to confirm safe concentration range of ellagic acid monomer of transport processes in Caco-2 cell monolayer model. The samples concentrations of ellagic acid were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).The apperent partion coefficient value(Papp)and the transport total amount were caculated. Bidirection transport behavior of ellagic acid by incubating in different concentration and time were study. ResultsThe transport cumulative amount of ellagic acid with incubation time, the administration concentration was positively correlated, the Pappvalues of different concentration ellagic acid have differences and the absorption effect was stronger than platoon role. The efflux ratio (ER) values <1.5. ConclusionThe active transport of the ellagic acid monomer in the Caco-2 cell model was based on the active transport, Efflux proteins may not be involved in the transport process, ellagic acid belong to the hard absorption drugs.

Keywords:Caco-2 monolayer model; ellagic acid; HPLC; transport

[收稿日期：2015-10-23]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.002

中圖分類號：R963

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)02-0135-04

作者簡介：田莉(1974-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥新制劑研究與開發(fā)， E-mail： tianli109@126.corn。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81260668)；新疆醫(yī)科大學(xué)“ 天山英才工程” 專項基金(Y0382002)