陸平祝， 龍慶德， 常楚瑞， 彭建端， 金 燕， 王曉麗

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

貴州不同產(chǎn)地苦參生物總堿和總黃酮的含量比較

陸平祝， 龍慶德， 常楚瑞*， 彭建端， 金 燕， 王曉麗

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

為黔產(chǎn)苦參資源的保護(hù)利用提供依據(jù)，采用紫外分光光度法對(duì)貴州不同產(chǎn)地苦參的生物總堿和總黃酮的含量進(jìn)行研究。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地苦參有效成分含量的差異較大。其中，以畢節(jié)市大方縣和銅仁市思南縣的苦參生物堿含量最高，分別達(dá)15.6%和15.2%，明顯高于其他產(chǎn)地的苦參；六盤水市老鷹山的苦參總黃酮含量最高，為15.7%。

苦參； 生物總堿； 總黃酮； 紫外分光光度法； 貴州

苦參(Sophoraflavescensvar.flavescens)為豆科槐屬植物[1]，落葉亞灌木，10月掘取根部，干燥入藥；常見于沙地、山坡、灌叢和草地，全國(guó)各地廣泛分布，現(xiàn)貴州多地有野生種和栽培種。其干燥根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要化學(xué)成分為喹嗪啶類生物堿和異戊烯基黃酮類[2-3]，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)苦參的研究主要側(cè)重于苦參藥材及其復(fù)方制劑在抗腫瘤、抗病毒和抗感染等以及其質(zhì)量評(píng)價(jià)方面，并已形成婦科洗液、苦參針劑和苦參注射液等醫(yī)藥制劑[4-8]。隨著苦參用途的不斷增加，苦參原料的用量逐年增長(zhǎng)[9]。苦參藥材生物總堿和總黃酮的含量與生長(zhǎng)環(huán)境有密切關(guān)系[10]。為此，筆者于2015年對(duì)貴州不同產(chǎn)地苦參的生物總堿和總黃酮的含量進(jìn)行比較研究，以期為保護(hù)野生苦參資源，尋找適合苦參種植的基地，為貴州苦參種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及其資源綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 苦參藥材 采挖于貴州省21個(gè)不同區(qū)域(表1)。經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物學(xué)與生藥學(xué)教研室鑒定為苦參(S.flavercensAit.)的根。

1.1.2 試劑 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110780-201007110805-200508)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):Y05M6S1)，溴麝香草酚藍(lán)磷酸氫二鈉緩沖溶液，蘆丁、濃氨、三氯甲烷、醋酸鉀(KAC)和乙醇，均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，AS系列超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司，250 W，100 kHZ)，Q-250B高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)，UV-5800PC型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，HH-Z數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，DROGON移液槍(上海恒奇儀器有限公司)。

1.2 材料預(yù)處理

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加入25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇25 mL，制成0.2 g/L的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液；取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用 60%乙醇超聲溶解并定容至25 mL，得濃度為0.2 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 貴州不同產(chǎn)地苦參材料的來(lái)源

Table 1 The source ofS.flaescensfrom different regions in Guizhou

編號(hào)No．產(chǎn)地Site緯度E/°Latitude經(jīng)度N/°Longitude1銅仁市德江縣N28°15′E108°05′2貴陽(yáng)市龍洞堡N26°34′E106°46′3修文縣扎佐鎮(zhèn)N26°51′E106°42′4凱里市香爐山N26°36′E107°53′5麻江縣下司鎮(zhèn)N26°36′E107°58′6遵義市余慶縣N27°13′E107°53′7貴陽(yáng)市二戈寨N26°30′E106°43′8貴陽(yáng)市世紀(jì)城N26°36′E106°37′9貴陽(yáng)市水田鎮(zhèn)N26°44′E106°49′10興仁縣百德鎮(zhèn)N25°41′E105°26′11開陽(yáng)縣南江鄉(xiāng)N26°56′E106°58′12清鎮(zhèn)市百花湖N26°41′E106°31′13花溪區(qū)孟關(guān)鄉(xiāng)N26°24′E106°44′14黔南州龍里縣N26°27′E106°58′15貴陽(yáng)市大轉(zhuǎn)彎N26°49′E106°12′16六盤水老鷹山N26°33′E105°01′17畢節(jié)市大方縣N27°08′E105°36′18安順市平壩縣N26°24′E106°16′19銅仁市思南縣N27°40′E107°59′20貴陽(yáng)市花溪區(qū)N26°23′E106°37′21黎平縣高屯鎮(zhèn)N26°20′E109°09′

1.2.2 苦參生物總堿提取 參照文獻(xiàn)[12-13]的方法提取。將貴州不同產(chǎn)地的苦參干燥根粉碎，過(guò)3號(hào)篩(60目)，精密稱取約0.3 g加入具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液0.5 mL，然后加入三氯甲烷20 mL，塞上塞子，稱重并記錄，超聲波處理30 min，功率250 W，頻率33 kHz，待冷卻至室溫，稱其重量，再用三氯甲烷補(bǔ)足失重，搖勻，過(guò)濾，放入冰箱保存待用。

1.2.3 苦參總黃酮的提取 稱取1 g苦參根粉末，采用80%的乙醇約25.5 mL(固液比為1∶25)，超聲處理60 min，功率100 W，待冷卻至室溫，離心，取上清液，用80%乙醇定容至25 mL，搖勻即得。

1.3 最大波長(zhǎng)的選擇

1.3.1 苦參生物總堿 微量加樣槍吸取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL分別加入25 mL具塞試管中，水浴蒸干溶液后，加入溴麝香草酚藍(lán)磷酸氫二鈉緩沖溶液6 mL(pH 7.6) ，再精密加入三氯甲烷6 mL，塞上塞子劇烈振搖2 min，放置30 min，使水層和三氯甲烷層完全分層，棄上清液；以溴麝香草酚藍(lán)磷酸氫二鈉緩沖溶液6 mL+三氯甲烷6 mL為對(duì)照(CK)。采用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm進(jìn)行掃描，選擇標(biāo)準(zhǔn)品溶液呈最大吸收值的波長(zhǎng)作為含量測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.2 苦參總黃酮 參照文獻(xiàn)[14-17]的方法測(cè)定。精密吸取4 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL容量瓶中，先后加入4.0 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和5.0 mL 1.0 mol/L KAc 溶液，再加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置40 min；以4.0 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和5.0 mL 1.0 mol/L KAc 為空白對(duì)照(CK)。采用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，選擇標(biāo)準(zhǔn)品溶液呈最大吸收值的波長(zhǎng)作為含量測(cè)定波長(zhǎng)。

1.4 苦參生物總堿與總黃酮含量的測(cè)定

1.4.1 線性關(guān)系考察 1) 苦參生物總堿。用微量進(jìn)樣器精密吸取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL和300 μL分別加入25 mL具塞試管中，用1.3.1方法測(cè)定其吸光度，求出苦參總堿濃度(y1)與吸光度(x1)關(guān)系曲線的回歸方程。2) 苦參總黃酮。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL分別置于50 mL 容量瓶中，用1.3.2方法測(cè)定其吸光度，求出苦參總黃酮含量(y2)與吸光度(x2)關(guān)系曲線的回歸方程。并以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.4.2 精密度試驗(yàn) 分別取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)液100 μL加到5個(gè)25 mL具塞試管中，用1.3.1方法測(cè)定其吸光度，5次重復(fù)；取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液4 mL，用1.3.2方法測(cè)定其吸光度，6次重復(fù)。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱量0.3 g苦參粉末，共6份，用1.2.2方法提取苦參生物總堿，用1.3.1方法測(cè)定其吸光度。稱量1 g苦參粉末，共6份，用1.2.3方法提取苦參生物總堿，用1.3.2方法測(cè)定其吸光度。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別吸取苦參生物總堿、總黃酮供試品溶液，每隔30 min測(cè)定1次，持續(xù)4 h；精密吸取苦參總黃酮一供試品溶液，每隔30 min測(cè)定1次，持續(xù)3 h。

1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取已知含量的苦參總堿和苦參總黃酮提取物各9份，約0.3 g和1 g，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品適量。用1.3.1和1.3.2的方法進(jìn)行測(cè)定其吸光度，計(jì)算其含量及回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參生物總堿和總黃酮含量與吸光度的相關(guān)性及波長(zhǎng)測(cè)定

從圖1可知，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果擬合得到苦參總堿含量(y1)與吸光度(x1)在2.55～6.8 μg/mL存在良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y1=0.094 7x1-0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8；苦參總黃酮含量(y2)與吸光度(x2)在8～24 μg/mL存在良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y2=0.029 0x2-0.009 4，R2=0.999 1。

從圖2可知，苦參生物總堿最大吸收值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為413 nm，苦參總黃酮最大吸收值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為420 nm，因此，分別選擇413 nm和510 nm作為苦參生物總堿和苦參總黃酮含量的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 回收率與精密度

經(jīng)測(cè)定：苦參生物總堿標(biāo)準(zhǔn)液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD精密度=0.68%，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的RSD精密度=0.76%?？鄥⑺幉纳锟倝A的平均含量為0.36%，RSD重復(fù)性=0.62%；其總黃酮平均含量為4.66%，RSD重復(fù)性=0.80%?？鄥⑺幉纳锟倝A和苦參總黃酮的平均含量穩(wěn)定，其提取液的平均含量分別為4.09%(4 h內(nèi)，RSD穩(wěn)定性=1.0%)和4.98%(3 h內(nèi)，RSD穩(wěn)定性=1.38%)。從表2可知：苦參生物總堿提取物的加樣回收率在95.68%～99.28%，平均為97.23%，RSD=1.10%；總黃酮的加樣回收率在95.41%～99.24%，平均為96.50%，RSD=1.16%。說(shuō)明，回收率符合含量測(cè)定要求。

圖1 苦參總堿和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.1 Matrine standard curve and rutin Standard curve

圖2 苦參堿和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜

Fig.2 Reference substance wavelength scanning matrine and rutin

表2 苦參藥材提取物的加樣回收率

注：*表示苦參總黃酮的樣品中含量、標(biāo)準(zhǔn)品加入量和測(cè)得量的單位為mg。

Note: * represented the content of sophora alkaloids in sample. Unit for adding amount of standard substance and measured value was mg.

2.3 貴州不同產(chǎn)地苦參生物總堿和總黃酮的含量

從表3可知，21個(gè)產(chǎn)地的苦參生物總堿和總黃酮含量差別較大。產(chǎn)于畢節(jié)市大方縣和銅仁思南縣苦參干燥根的生物總堿含量分別為15.6%和15.2%，明顯高于其他產(chǎn)地；六盤水市苦參干燥根的生物總堿含量最低，為1.58%，但其苦參總黃酮含量最高，為15.7%。建議苦參藥材培育基地的選擇可根據(jù)自身需求定。

表3 貴州不同產(chǎn)地苦參的生物總堿和總黃酮含量

3 結(jié)論與討論

利用紫外分光度法測(cè)定苦參藥材生物總堿和總黃酮含量的方法簡(jiǎn)單、可靠。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地黔產(chǎn)苦參有效成分含量的差異較大，其中，以畢節(jié)市大方縣和銅仁市思南縣的苦參生物堿含量最高，分別達(dá)15.6%和15.2%，明顯高于其他產(chǎn)地的苦參；六盤水市老鷹山的苦參總黃酮含量最高，為15.7%。

目前，貴州多地有野生苦參和栽培品，該試驗(yàn)較全面地反映不同產(chǎn)地黔產(chǎn)苦參生物總堿和總黃酮的含量狀況存在較大差異。說(shuō)明，黔產(chǎn)苦參生物總堿和總黃酮含量的區(qū)域性較強(qiáng)。近幾年，苦參原藥的需求逐步增大，因此，應(yīng)選擇適宜苦參種植區(qū)域栽培以提高產(chǎn)量。如何確定苦參藥材的藥源基地，有待于進(jìn)一步研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010版(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:188.

[2] 張 翅，馬 悅，高慧敏，等.苦參化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,20(4):205-214.

[3] 趙 平，張穎君，山本浩文，等.苦參異戊烯基黃酮類化合物的化學(xué)，活性及其生物合成研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004,16(2):172-178.

[4] 付佃華，付亞杰，張棟棟.苦參堿在婦科疾病方面的實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)展[J].基層醫(yī)學(xué)論壇，2015,19(4):551-552.

[5] 彭向前，張文會(huì)，李 軍.氧化苦參堿和拉米夫定體外抗乙肝病毒的作用[J].中國(guó)生化藥物雜志，2012,33(2):142-144.

[6] 任衍菊，張玉萍，金 敏，等.氧化苦參堿體外抗乙型肝炎病毒作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012,7(18):175-179.

[7] 劉 欣，索智敏.苦參抗乙肝病毒的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)生化藥物雜，2015(35):67-69.

[8] 陳曉峽，向小慶，葉 紅.苦參堿及氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013,19(11):361-364.

[9] 劉 濤，王 羅，吳南軒，等.苦參提取物質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,33(3)：197-199.

[10] 劉龍?jiān)?，潘海運(yùn)，李書淵，等.苦參異地栽培對(duì)其生長(zhǎng)與氧化苦參堿含量的影響[J].中藥材，2013(10):1569-1572.

[11] 付起鳳，曹 琦，呂邵娃，等.正交法優(yōu)化苦參中苦參生物堿的超聲提取工藝[J].中醫(yī)藥信息，2015,32(1):11-13.

[12] 那 娜，紀(jì)麗麗.超聲波法提取苦參總堿的研究[J].黑龍江科學(xué)，2012,3(1):9-11.

[13] 鐘彩娜，鐘 文，伍嚴(yán)利.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選苦參生物堿的提取工藝[J].醫(yī)學(xué)信息臨床醫(yī)學(xué)，2011,24(9):6038-6039.

[14] 高紅寧，殷 奕.苦參藥材中氧化苦參堿和苦參總黃酮含量比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013,19(17):66-69.

[15] 鄭津輝，王 威，黃 輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2008,54(4):439-442.

[16] 李 艷，張麗艷，楊玉琴，等.黔產(chǎn)苗藥石吊蘭黃酮類成分含量對(duì)比研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011,13(3)：11-13.

[17] 馬鴻雁，周婉珊，褚夫江，等.苦參中黃酮類成分的高效液相指紋圖譜及5種成分的含量測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志，2013,38(16):2690-2695.

(責(zé)任編輯： 王 海)

Comparative Study on Contents ofSophoraAlkaloids and Flavonoids from Different Habitats of Guizhou

LU Pingzhu, LONG Qingde， CHANG Churui*, PENG Jianduan, JIN Yan, WANG Xiaoli

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

To provide basis for protection and utilization ofS.flavescensresources in Guizhou, UV spectrophotometry was employed to analyze the contents of sophora alkaloids and flavonoids from different habitats of Guizhou. Results: Active ingredient concentration ofS.flavescensvaried greatly from different habitats. Sophora alkaloids content were the highest from Dafang County of Bijie City and Sinan County of Tongren City, respectively 15.6% and 15.2%, significantly higher than that from other habitats. Flavonoids from Laoyingshan of Liupanshui City was the highest, which was 15.7%.

Sophoraflavescens; alkaloids; flavonoids; UV spectrophotometry; Guizhou

2015-10-23； 2016-04-25修回

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)“黔產(chǎn)大宗藥材金櫻子、苦參質(zhì)量評(píng)價(jià)研究”[黔科合ZY字(2012)3004]，“貴州省15種重點(diǎn)發(fā)展藥材的加工炮制技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用”[黔科合重大專項(xiàng)字(2015)6009-2]

陸平祝(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：生藥學(xué)。E-mail: 1435962566@qq. com

*通訊作者：常楚瑞(1973-)，女，副教授，博士，從事生藥學(xué)及中草藥研發(fā)工作。E-mail：changchurui@hotmail.com

1001-3601(2016)05-0218-0120-04

S567.5+3

A