何 進(jìn)， 李 平*， 謝體波， 黨 娟， 吳紫潔， 何方洋，2

(1.貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司， 貴州 貴陽(yáng) 550009； 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司， 北京 100012)

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法檢測(cè)肉制品中的磺胺類藥物殘留

何 進(jìn)1， 李 平1*， 謝體波1， 黨 娟1， 吳紫潔1， 何方洋1，2

(1.貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司， 貴州 貴陽(yáng) 550009； 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司， 北京 100012)

為快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)到肉制品中的磺胺類藥物殘留，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法對(duì)雞肉、魚肉、蝦肉中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，并與儀器法測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法的靈敏度為1 μg/kg，3類樣品的最低檢測(cè)限均為0.864 μg/kg。磺胺類藥物的添加回收率在94.33%～104.28%，RSD在1.2%～6.5%；檢測(cè)結(jié)果與儀器法一致，且具有成本低、檢測(cè)快、檢測(cè)批量大等優(yōu)點(diǎn)，適用于肉制品中磺胺類藥物的殘留檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光試劑盒； 磺胺； 肉制品； 殘留檢測(cè)

磺胺類藥物(Sulfonamides，SA)是具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，其抗菌譜較廣，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌以及陰性菌有抑制作用，具有性質(zhì)穩(wěn)定，品種多、價(jià)格低和使用簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑或動(dòng)物疾病治療藥物[1]。但是人類經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動(dòng)物性食品可引起磺胺類藥物在體內(nèi)逐漸累積。其危害性主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌及激素樣作用等[2-3]。隨著社會(huì)的發(fā)展，磺胺類藥物的不合理使用，使其在動(dòng)物性食品中殘留引起生態(tài)環(huán)境污染和危害人類健康的潛在威脅備受關(guān)注，成為人類亟待解決的問題之一，而各類檢測(cè)方法也隨之應(yīng)運(yùn)而生。

目前，磺胺類藥物的檢測(cè)方法主要有微生物學(xué)法、理化分析方法和免疫法等。微生物法因操作費(fèi)時(shí)且靈敏度、特異性都較差，在定性定量上存在困難，不能滿足現(xiàn)代殘留檢測(cè)的需要而未得到廣泛應(yīng)用[4]。理化法常作為確證方法檢測(cè)動(dòng)物組織中磺胺類藥物的殘留，主要有液相色譜法(HPLC)[5-7]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)[8-10]等，此法雖準(zhǔn)確、靈敏、高效，但前處理過程較繁瑣，儀器較昂貴，且需專業(yè)人員來(lái)操作，故其應(yīng)用也受到一定限制[11]。免疫分析法主要為酶聯(lián)免疫法與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法，該法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、可批量檢測(cè)，具有較好的發(fā)展前景[12]。為尋求快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)到肉制品中的磺胺類殘留物質(zhì)，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)對(duì)肉制品中的磺胺類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以保障消費(fèi)者免受肉制品中磺胺類藥物殘留的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

磺胺化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析測(cè)定試劑盒(貴州勤邦生物科學(xué)技術(shù)有限公司)，磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：純度>99.5%(美國(guó)Sigma公司),氫氧化鈉(滄州眾信化工有限公司),乙腈(美國(guó)spectrum公司),乙酸乙酯(蘇州德榮化工)。

儀器：磁免疫全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(德國(guó)拜耳公司)，氮吹儀(DSY-111，上海喬躍電子科技有限公司)渦旋儀(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，均質(zhì)器(CJ-04，上海丙林電子科技有限公司)，離心機(jī)(GT16—3A，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)。電子天平(AL-204，沈陽(yáng)龍騰電子科技有限公司)，微量移液管(單道20～200 μL，100～1 000 μL，美國(guó)Thermo公司)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 樣品前處理

雞肉、魚肉和蝦肉，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取(2.0±0.05)g樣本于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入3.8 mL乙腈-NaOH(0.1 mol/L)溶液，再加入2 mL乙酸乙酯，渦動(dòng)混勻，室溫(20～25℃)3 000 r/min離心5 min；移取3 mL上層有機(jī)相至10 mL潔凈干燥玻璃管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加? mL正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)1 min，再加1 mL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)1 min，室溫(20～25℃)3 000 r/min，離心5 min；除去上層有機(jī)相，取下層水相用于分析。

1.3 磺胺類藥物的測(cè)定

取出試劑盒內(nèi)微孔板，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品對(duì)應(yīng)微孔空編號(hào)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做3孔平行，記錄樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)孔位置。各微孔中分別加50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、50 μL酶標(biāo)抗體和50 μL磁標(biāo)抗體工作液，混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光反應(yīng)30 min。揭開蓋板膜，甩干孔內(nèi)液體，按250 μL/孔加入洗滌工作液，每10 s洗滌1次，充分洗滌4～5次，用吸水紙拍干。分別按50 μL/孔加入底物A液和B液，混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光反應(yīng)；15 min后按50 μL/孔加入終止液，混勻，設(shè)定反應(yīng)杯于450 nm處且在5 min內(nèi)測(cè)完OD值，并記錄。

1.3.1 磺胺類藥物濃度的計(jì)算 分別對(duì)0 μg/L、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L和81 μg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行CMIA檢測(cè)，測(cè)定RLU值。以磺胺類藥物濃度對(duì)數(shù)值(Log)為橫坐標(biāo)，各對(duì)應(yīng)濃度的抑制率(RLU/RLU)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 精密度的測(cè)定 精密度又稱可重復(fù)性，反映測(cè)定方法對(duì)某一特定樣品多次測(cè)定所得結(jié)果的重復(fù)程度，這是評(píng)定化學(xué)發(fā)光試劑盒質(zhì)量最基本的參數(shù)，常用變異系數(shù)表示。在檢測(cè)為陰性的雞肉樣本中添加2 μg/L磺胺類藥物，做6個(gè)平行，用試劑盒提供的操作方法提取測(cè)定，計(jì)算測(cè)定樣品的變異系數(shù)。

1.3.4 樣品添加回收試驗(yàn) 取空白雞肉、魚肉、蝦肉樣品以1 μg/L、2 μg/L和4 μg/L磺胺類藥物進(jìn)行添加，每種樣品、每個(gè)濃度各5個(gè)平行。

1.3.5 儀器對(duì)比試驗(yàn) 隨機(jī)采購(gòu)雞肉、魚肉、蝦肉樣本各20份，分別用CMIA法和HPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。儀器方法參考國(guó)標(biāo)GB/T 21316—2007[14]。

1.4 結(jié)果計(jì)算

百分吸光率=B/B0×100%，式中，B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)濃度，乘以其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)即為樣品中磺胺類試劑的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖示可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-40.45x+77，R2=0.993，其中磺胺類藥物的IC50值為4.0 μg/L，說(shuō)明磺胺類藥物試劑盒的線性關(guān)系良好，可以滿足殘留分析的要求。

2.2 試劑盒的檢測(cè)限及精密度

檢測(cè)限：由表1可知，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定20次空白雞肉磺胺類藥物的平均值為0.303 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差為0.187 μg/kg，最低檢測(cè)限為0.864 μg/kg。

精密度：通過測(cè)定，磺胺類藥物測(cè)定試劑盒的變異系數(shù)分別為2.36%、1.96%、2.54%、4.32%、3.11%、2.08%、3.68%、4.21%、2.87%、1.19%，均小于10%，說(shuō)明該試劑盒重現(xiàn)性好，性能較為穩(wěn)定，具有較好的精密度。

圖示 磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

Table 1 Detection results of 20 blank chicken samples of sulfonamides μg/kg

表2 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定3種肉制品中磺胺類 藥物的試劑盒添加回收率

Table 2 Addition recovery of 3 meat products of SA kit by CMIA

樣品名Nameofsamples添加濃度/(μg/L)Additionconcentration平均回收率/%AveragerecoveryRSD/%雞肉1．0100．115．4 Chicken2．095．946．54．094．361．2魚肉1．0105．143．1 Fishflesh2．097．774．24．096．583．6蝦肉1．096．582．1 Shrimp2．0104．282．54．094．333．7

表3 CMIA與HPLC-MS/MS法測(cè)定肉制品中 磺胺類物質(zhì)的結(jié)果

Table 3 Detection of sulfonamides in meat products by CMIA and HPLC-MS/MS

樣本Samples樣本號(hào)SamplenumberCMIAHPLC?MS/MS樣本號(hào)CMIAHPLC?MS/MS雞肉1--11-- Chicken2241．123512--3--13--4--14--5--15--6--16147．5144．77--17--8--18--9--19--10--20--魚肉1--11-- Fishflesh2--12145．9140．53--13--4--14--5--15--6214．8210．51682．4807--17--8--18--9--19--10--20--蝦肉1--11-- Shrimp2--12--395．190．513--4--14--5--15167．5164．86--16--7--17--887．485．918--9--19--10--20--

注：-表示未檢出

Note:-,Non-detected

2.3 樣品添加回收率

由表2可知，磺胺類藥物在雞肉、魚肉、蝦肉中的添加回收率在94.33%～105.14%，RSD在1.2%～6.5%，表明化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定磺胺類藥物的添加回收率符合我國(guó)獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)[13]。

2.4 CMIA與HPLC-MS/MS法的測(cè)定結(jié)果

由表3可知，CMIA法與儀器法測(cè)定結(jié)果一致，吻合度達(dá)到100%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確，適用于雞肉、魚肉、蝦肉中磺胺類藥物的殘留檢測(cè)。3種基質(zhì)共60份樣品中，檢出限超過國(guó)標(biāo)(50 μg/kg)的共16份，檢出率為25%，表明我國(guó)磺胺類藥物在動(dòng)物性組織中的殘留存在超標(biāo)情況，雖不嚴(yán)重，但應(yīng)引起相關(guān)職能部門的注意，做到防患于未然。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法對(duì)雞肉、魚肉、蝦肉中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，方法靈敏度為1 μg/kg，3類樣品的最低檢測(cè)限均為0.864 μg/kg?；前奉愃幬镌陔u肉中添加回收率為94.36%～100.11%，RSD為1.2%～6.5%；魚肉中磺胺類藥物添加回收率為96.58%～105.14%，RSD為3.1%～4.2%；蝦肉中磺胺類藥物的添加回收率為94.33%～104.28%，RSD為2.1%～3.7%。與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相比，檢測(cè)結(jié)果一致，但檢測(cè)時(shí)間短、前處理簡(jiǎn)單、成本低、批次檢測(cè)量大，適用于雞肉、魚肉和蝦肉等肉制品中磺胺類藥物的大批量快速檢測(cè)。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Detection of Sulfonamides Residues in Meat Products by CMIA

HE Jin1, LI Ping1*, XIE Tibo1, DANG Juan1, WU Zhijie1, HE Fangyang1，2

(1.GuizhouKwinbonFoodSafetyScience&TechnologyCo.,Ltd.,Guiyang,Guizhou550009; 2.BeijingKwinbonFoodSafetyScience&TechnologyCo.,Ltd.,Beijing100012,China)

The sulfonamides residues in chicken, fish flesh and shrimp were detected by CMIA and HPLC-MS/MS respectively to rapidly and easily detect sulfonamides in meat products and guarantee consumers’ personal rights. Results:The sensitivity of CMIA is 1 μg/kg and the lowest detectable limit of chicken, fish flesh and shrimp all is 0.864 μg/kg. The addition recovery of SA is 94.33%～104.28% andRSDis 1.2%～6.5%, which is consistent with that of HPLC-MS/MS. CMIA with the advantages of low cost, rapid detection, large batch popularization potential can be suitably used in SA residue detection in meat products.

chemiluminescent kit; sulfonamides; meat product; residue detection

2016-01-11； 2016-05-04修回

2013創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目“全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析食品安全快速檢測(cè)系統(tǒng)研發(fā)”[筑科合同(2013)209-01]；2014貴州省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)基金計(jì)劃項(xiàng)目“動(dòng)物源性食品中獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化及推廣應(yīng)用”[黔科合成轉(zhuǎn)字(2014)5104]；2015貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目“農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)集成研究與應(yīng)用示范”[黔科合NY(2015)3016-1]

何 進(jìn)(1988-)，女，工程師，從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。E-mail: 245208083@qq.com

*通訊作者：李 平(1986-)，女，工程師，碩士，從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。E-mail：294173456@qq.com

1001-3601(2016)05-0225-0148-04

S851.34+7

A