吳躍開 余金勇 朱秀娥

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 貴陽 550005)

貴州核桃枝枯病病原菌的初步鑒定

吳躍開 余金勇 朱秀娥

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 貴陽 550005)

在貴州省龍里縣某核桃種植基地，近幾年來枝枯病一直嚴(yán)重發(fā)生危害，病原菌主要侵染梢、枝甚至主干，導(dǎo)致枝梢枯萎甚至全株死亡。通過一系列的實(shí)驗(yàn)研究，包括病菌的分離培養(yǎng)、致病性接種、形態(tài)特征觀測以及rDNA-ITS序列分析，證實(shí)引起該病的病原菌為越橘間座殼(DiaporthevacciniiShear)。由該菌引起的核桃枝枯病在國內(nèi)外系首次報道。

核桃；枝枯??；病原菌；越橘間座殼

核桃是十分重要的經(jīng)濟(jì)果樹，目前在我國20多個省市都有大面積栽培，種植數(shù)量和產(chǎn)量均居世界首位。隨著國內(nèi)外核桃需求量的不斷增加，核桃產(chǎn)業(yè)必將成為我國許多農(nóng)村地區(qū)脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。貴州是我國核桃主產(chǎn)區(qū)之一，得天獨(dú)厚的自然條件為核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了十分廣闊的空間，省委、省政府高度重視核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展，出臺了《貴州省核桃產(chǎn)業(yè)化扶貧建設(shè)規(guī)劃(2011～2015年)》，提出到2018年發(fā)展100萬公頃核桃的戰(zhàn)略目標(biāo)。

然而，核桃病蟲害的發(fā)生,危害正成為我省核桃產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重大制約因素。其中，核桃枝枯病是一種十分嚴(yán)重的病害種類，它的發(fā)生常常導(dǎo)致大量中幼齡核桃樹的枝條枯死甚至全株死亡，不但造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時還嚴(yán)重影響了核桃種植戶的積極性，有的甚至已經(jīng)計劃改種其它作物。為了掌握該病的確切病因，從而采取有針對性的防治措施，我們對該病的病原學(xué)進(jìn)行了初步研究。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

所調(diào)查核桃種植基地位于貴州省龍里縣擺省鄉(xiāng)，面積約7公頃多，所栽核桃均為嫁接苗(接穗來源地不明)。病害調(diào)查內(nèi)容主要包括枝枯病的發(fā)病時間、發(fā)病癥狀、受害株率、危害程度、為害后果等。

1.2 病害采樣及分離培養(yǎng)

采集具有典型癥狀的當(dāng)年病枝，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。對采集到的病害標(biāo)本盡快實(shí)施病菌分離操作，分離部位包括病健交界處組織、病部中間組織以及病菌子實(shí)體(分生孢子座)。分離前將病枝用自來水沖洗干凈，再用75%乙醇擦洗消毒，然后用消毒的刀片切開，用接種針挑取相應(yīng)的病部組織迅速轉(zhuǎn)入試管，在28 ℃恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)出的培養(yǎng)物各通過2次轉(zhuǎn)管進(jìn)行純化，最終所獲培養(yǎng)物(菌株)按采集地點(diǎn)、采集時間及標(biāo)本號進(jìn)行統(tǒng)一編號，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性接種試驗(yàn)

往純化的試管菌種中加入無菌水并攪勻以制成孢子懸浮液。供試核桃樹苗選用健康無病的2年生容器嫁接苗，一共20株，分成4組，分別進(jìn)行不同處理：①在接種前用刀片輕輕刮傷莖皮，然后涂抹菌液；②不作刮傷處理，直接涂抹菌液(對照1)；③刮傷處理，然后涂抹無菌水；④不作刮傷處理，直接涂抹無菌水(對照2)。將各試驗(yàn)苗露天擺放，但各處理的苗木要保持相隔一段距離(避免交叉感染)。試驗(yàn)期間室外氣溫20～32℃，相對濕度>90%。一周后觀察發(fā)病情況。

1.4 病原菌形態(tài)特征觀測

對已經(jīng)產(chǎn)生子實(shí)體的標(biāo)本，可直接進(jìn)行徒手切片，在顯微鏡下觀測記錄子實(shí)體結(jié)構(gòu)、大小以及其中孢子的形態(tài)特征。對人工分離物進(jìn)行鏡檢時，則包括菌落形態(tài)、生長速度、顏色，分生孢子形態(tài)、大小、顏色，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形態(tài)等特征。

1.5 分子生物學(xué)研究

所獲得的純培養(yǎng)菌落委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行ITS序列測定。依據(jù)ITS序列，采用MEGA4.0中的鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行1000次可信度分析。

1.6 病原的分類鑒定。

根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合分子生物學(xué)研究結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，對病原物進(jìn)行分類鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害危害情況

2014年至2015年連續(xù)兩年的調(diào)查結(jié)果表明，核桃枝枯病在所調(diào)查的核桃幼林中發(fā)生嚴(yán)重，其發(fā)病高峰期一般在4～5月間。通過實(shí)地調(diào)查，感病株率高達(dá)85%，其中受害程度為中、重度的占70%。受害植株的枝條大量枯死，少數(shù)全株死亡。

2.2 病癥特點(diǎn)

病原菌可侵染核桃植株的任何部位，包括新發(fā)的嫩梢嫩葉、復(fù)葉柄、枝及主干，導(dǎo)致枝條枯死甚至全株死亡。侵染嫩梢、嫩葉時，梢、葉變黑干枯；侵染枝、干部位時，初期表現(xiàn)為一小型的暗色漬狀斑，隨后逐漸擴(kuò)大，病部皮層顏色因此也變暗變黑，其下組織變黑腐爛并常向外滲水，有酒糟味(圖1，A-C)。后期病部變黑干枯，其上著生許多黑色的顆粒狀物(子座)，子座成熟時上部開裂，潮濕條件下還會通過裂口往外溢出淡黃色半透明的卷曲的分生孢子角(圖2，A-C)。

值得一提的是，嫁接苗所用砧木一般不感病，表明本土實(shí)生苗對該菌具有顯著的抗性。

2.3 病原形態(tài)特征

載孢體為真子座(分生孢子座)，埋生于皮層下，成熟后外露，其形狀為球形、橢球形，常匯合成其它形狀，單個平均直徑為400～700μm(多數(shù)550～650μm)，器壁黑色有光澤，其內(nèi)部組織溶解成不規(guī)則的迂回曲折的腔體(分生孢子腔)(圖3-A)；腔內(nèi)分生孢子梗較短，寬約1.2μm，長10～15μm(圖3-B)。子座在后期會發(fā)生開裂，其裂口大，呈紡錘形、三角形、梯形等多種形狀，潮濕條件下從中伸出淺黃透明的分生孢子角。

圖1 核桃枝枯病野外發(fā)病癥狀 A-新梢感病枯死；B-主干感病；C-主干病部組織發(fā)生腐爛而變褐、變黑

圖2 核桃枝枯病子實(shí)體 A-較老病枝上出現(xiàn)大量病菌子實(shí)體；B-子實(shí)體放大；C-從子實(shí)體溢出分生孢子角

圖3 核桃枝枯病病原特征 A-子座縱剖面，示其內(nèi)部發(fā)生溶解而形成不規(guī)則的分生孢子腔；B-分生孢子腔內(nèi)的分生孢子梗；C-分生孢子梗及BETA型分生孢子。

PDA培養(yǎng)基上，菌落生長速度很快，平均每天生長10～12 mm。初白色，圓形，氣生菌絲較疏松(不緊密)，邊緣較薄。一周后，菌落直徑可達(dá)58～60mm，同時會呈現(xiàn)不太顯著的同心圓環(huán)(后期子座也大致于同心環(huán)上產(chǎn)生)(圖4-A)。較老的菌落顏色往往變薄，呈灰色、灰黃色甚至暗黑色。子座7～10天后開始產(chǎn)生，至3～4周成熟。子座黑色，球形至不規(guī)則形，大，基部較寬，直徑1.0～1.3mm，分散單生或多個匯合聚生(圖4-B)，常見乳白色或乳黃色的分生孢子團(tuán)從成熟的分生孢子器頂部的孔口溢出。分生孢子具兩種類型，其中甲型(α型)分生孢子近圓柱形或近紡綞形、長橢圓形，單胞(胞內(nèi)含雙油滴)，無色，較直，兩端鈍圓，大小為2.2～2.5×6.0～7.5μm；乙型(β型)分生孢子線形，單胞無色，直或一端彎曲，大小為1.2～1.4×21.2～36.3μm。分生孢子梗短，頂部狹，有時呈梭形(圖4-C)。

2.4 致病性測試結(jié)果

由于室外致病性接種試驗(yàn)期間的氣溫較高、濕度較大，人工接種后病菌發(fā)展很快，不論是刮傷接種還是未刮傷接種，一周后觀察都可見接種部位呈現(xiàn)顯著的漬狀暗褐色病斑，其中刮傷接種組的病斑明顯較大，色澤也較深呈黑色。相比之下，兩個對照組均不發(fā)病。對接種后產(chǎn)生的病斑進(jìn)行病菌的再分離培養(yǎng)，所獲菌株與試驗(yàn)用菌株形態(tài)特征一致，符合柯赫氏法則。

2.5 DNA序列分析結(jié)果

利用Blast 軟件，將引物ITS4測序結(jié)果獲得的ITS片段序列與GenBank中收錄的DNA序列進(jìn)行比對，并與相關(guān)同屬菌物構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖 )。結(jié)果表明，待測菌種樣品(HTZK1401)與Diaporthe vaccinii(Accession No.KC488258)聚成一支，同源度達(dá)99%(圖5)。

2.6 病原菌的鑒定

α型及β型孢子的出現(xiàn)是擬莖點(diǎn)霉屬真菌(Phomopsis)的獨(dú)有特征，但該屬的許多種在形態(tài)特征上均十分相似，常常無法通過形態(tài)特征予以區(qū)別。因而，依據(jù)高度保守的真菌rDNA ITS區(qū)序列的比較分析，可以作為這類真菌可靠的輔助鑒定手段。本研究根據(jù)病菌的侵染危害特點(diǎn)、形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS序列的測定與比對結(jié)果，參考相關(guān)的文獻(xiàn)資料(Ramsdell 1995; Farr et all. 2002；OEPP/EPPO 2009)，初步確認(rèn)引起核桃枝枯病的病原菌為越橘間座殼DiaporthevacciniiShear(無性型為烏飯樹擬莖點(diǎn)霉PhomopsisvacciniiShear)。

不過，需要指出的是，本研究中病原菌的形態(tài)特征與相關(guān)文獻(xiàn)資料的描述(包括分生孢子大小)存在一定的差異(Ramsdell 1995；Farr et all. 2002)，同時這些歷史資料相互間對該菌的描述也不盡相同。這表明，由于生長條件(寄主、生長環(huán)境、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等)的不同，病菌的形態(tài)特征會產(chǎn)生一定的差異。

圖5 核桃枝枯病病原菌(HTZK1401)的系統(tǒng)發(fā)育樹

到目前為止，無論是在野外，還是人工培養(yǎng)中，均未發(fā)現(xiàn)其子囊(有性)世代Diaporthe vaccinii Shear。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料的描述，其子囊殼直徑為0.3～0.5×0.2～0.4mm，球形，近基部稍扁，具黑色的厚的多層壁, 成熟子囊殼具一長頸，突出于寄主表皮之上，子囊37～51×7～12μm, 長橢圓形，無柄, 頂部加厚并具一緊致的小孔。每一子囊含8個子囊孢子，子囊孢子大小8～12×2～3μm, 雙胞具油滴，橢圓形，分隔處稍縊縮(Caruso & Ramsdell 1995)。

3 結(jié)論與討論

此前，文獻(xiàn)記載危害核桃樹的擬莖點(diǎn)霉屬真菌有P.elaeagni(Green, R. J. Jr, 1977)以及P.juglandina(孫俊，2013)而由PhomopsisvacciniiShear引起的核桃枝枯病在國內(nèi)外均系首次報道。

P.vacciniiShear及其有性型D.vacciniiShear 原產(chǎn)北美，最初在杜鵑花科越桔屬植物大果越桔(Vacciniummacrocarpon)及紅莓苔子(V.oxycoccosL.)上發(fā)現(xiàn)并被描述(Shear et al., 1931)，在美國及加拿大的越桔屬植物種植區(qū)廣泛分布(Shear et al. 1931; Weingartner & Klos 1975; Chao & Glawe 1985; Farr et al. 2002; Tadych et al. 2012)。這一病原菌一直被認(rèn)為具有較強(qiáng)的寄主專一性(即專門為害越桔屬植物)，危害寄主植物的枝干、梢、葉及果實(shí)，導(dǎo)致潰瘍病、梢枯、枝枯、果腐(Chao & Glawe 1985；OEPP/EPPO 2009)，因而是這類植物的重要病原菌之一，檢疫意義十分重大。目前，該病菌已經(jīng)傳入到北美以外的其它許多國家與地區(qū)，包括南美的智利 (Chao & Glawe 1985; Weingartner& Klos 1975)以及歐洲的羅馬尼亞(Teodorescu et al.1985)、英國(Wilcox & Falconer 1961; Baker 1972)、立陶宛(Gabler et al. 2004; Ka?ergius et al. 2004)、拉脫維亞以及荷蘭(Lombard et al.2014)等。

由D.vaccinii引起的核桃枝枯病應(yīng)當(dāng)引起我們的極大關(guān)注。首先，傳統(tǒng)上認(rèn)為該病原菌寄主專一性強(qiáng)，專門為害越桔屬植物，我們的研究首次證明其能夠寄生危害其它科屬的寄主植物，并造成嚴(yán)重的危害后果。這表明，隨著環(huán)境的改變，某些傳統(tǒng)上認(rèn)為的專一性病原菌也可能會侵染傳統(tǒng)寄主之外的其它植物。對此的解釋是，D.vaccinii本身可能具有較高的種內(nèi)遺傳多樣性，這一假設(shè)有待我們進(jìn)一步深入研究。其次，由于近年來越桔屬經(jīng)濟(jì)植物(尤其是藍(lán)莓)在國內(nèi)(包括貴州省)的種植面積在不斷擴(kuò)大，該病菌蔓延擴(kuò)散危害的潛在可能性極大，這一點(diǎn)應(yīng)引起有關(guān)部門的高度重視。第三，鑒于該病的侵染性極強(qiáng)，造成的潛在危險性極大，當(dāng)務(wù)之急是對其生物學(xué)特性、發(fā)生發(fā)展規(guī)律及相應(yīng)的防治措施進(jìn)行深入的試驗(yàn)研究。

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Identification of the Causal Agent of Branch Blight Disease of Walnut Trees in Guizhou

WU Yue-kai YU Jin-yong, ZHU Xiu-e

(Guizhou Academy of Forestry, Guiyang, Guizhou,550005)

In a walnut plantation located in Longli county of Guizhou province, the walnut trees suffered serious branch blight disease. The causal agent mainly invade the leaves, shoots, branches, and even the stems, resulting in the wilting of the branch or even the death of whole tree. In order to identify the causal agent, a series of studies were carried out including the isolation, cultivation, pathogenicity test, morphological observation, as well as the rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the causal agent of the walnut branch blight isDiaporthevacciniiShear. This is the first report of this fungus as the causal agent of walnut branch blight disease.

walnut; branch blight disease; causal agent;DiaporthevacciniiShear

2016-03-10

吳躍開(1972 ～ )，男(侗族)，貴州黎平人，副研究員，主要從事植物保護(hù)及有益生物開發(fā)利用研究。

貴州省科技廳重大專項(xiàng)課題“貴州省核桃產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(黔科合重大專項(xiàng)字[2011]6011 號)

S763.102

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