宋晶心，董村，張理濤，王晉，王璽

（1．天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津300112；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；4.天津醫(yī)科大學，天津300070）

·論著·

柳蘑多糖對角質(zhì)形成細胞作用實驗研究

宋晶心1，董村2，張理濤3，王晉3，王璽4

（1．天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津300112；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；4.天津醫(yī)科大學，天津300070）

目的觀察柳蘑多糖對角質(zhì)形成細胞株（HaCat細胞）生物學性狀的影響，并探討其相關作用機制。方法MTT法檢測柳蘑多糖對HaCat細胞增殖活性的影響；Annexin V-PI染色法測定柳蘑多糖刺激HaCat細胞后的凋亡情況；PI法測定應用柳蘑多糖刺激后HaCat細胞周期的改變；重組人γ-干擾素（rhIFN-γ）誘導HaCat細胞活化，然后加入柳蘑多糖，用ELISA法檢測IL-8和ICAM-1細胞因子分泌情況。結(jié)果MTT法證實柳蘑多糖對HaCaT細胞的增殖有抑制作用，且最佳抑制濃度為0.1 μg/mL，最佳作用時間為48 h；用Annexin V-PI染色法證實了柳蘑多糖可以促進HaCaT細胞凋亡，尤其是晚期凋亡；用PI法證實了柳蘑多糖可以影響HaCaT細胞的細胞周期，對細胞DNA合成期有影響；用ELISA法證明了rhIFN-γ活化后HaCaT細胞分泌的白介素-8（IL－8）及細胞間黏附分子-1（ICAM-1）明顯增多，而柳蘑多糖可以使活化后HaCaT細胞分泌的IL-8及ICAM-1顯著減少。結(jié)論柳蘑多糖可以抑制體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的增殖、促進角質(zhì)形成細胞凋亡、改變角質(zhì)形成細胞的細胞周期，減少細胞因子（IL－8，ICAM－1）分泌，提示柳蘑多糖有抑制角質(zhì)形成細胞增殖、減輕炎癥反應的潛力。

柳蘑多糖；HaCat細胞;銀屑病

角質(zhì)形成細胞（Keratinocyte，KC）是表皮最重要的細胞，在銀屑病皮損區(qū)中KC表現(xiàn)出角化過度、角化不全、顆粒層消失及棘層肥厚的病理改變。KC不僅可作為免疫反應的靶細胞，而且可以通過表面分子及分泌的細胞因子等作用于皮損中浸潤的炎細胞,尤其是T細胞，對其活性、功能及增殖能力等產(chǎn)生影響，這些都充分顯示了KC的增殖為銀屑病至關重要的致病因素之一，抑制其異常增殖是治療銀屑病的一種方法[1-2]。以往的研究表明，柳蘑軟膏治療尋常型銀屑病有效[3]，柳蘑軟膏的主要成分是柳蘑和蜂蠟，而由柳蘑中提取的柳蘑多糖可以抑制體外培養(yǎng)的成纖維細胞株，有一定的抗增生作用，并且有抗微生物作用[4-6]，另有研究表明柳蘑多糖具有免疫增強作用，有效地激活巨噬細胞[7]。本實驗觀察了柳蘑多糖對角質(zhì)形成細胞株（HaCaT細胞）的影響，目的是為了探討柳蘑軟膏治療尋常型銀屑病可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞材料 人角質(zhì)形成細胞株（HaCat細胞）（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學王璽課題組惠贈）。

1.2 試劑與儀器 重組人γ-干擾素（rhIFN-γ）、人IL-8 ELISA檢測試劑盒、人sICAM-1 ELISA檢測試劑盒（聯(lián)科生物），AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、DMEM培養(yǎng)基（南京凱基生物），胎牛血清（PAN-Biotech GmbH），二甲基亞砜（DMSO）、噻唑鹽（MTT）（GIBCO），胰酶（AMRESCO）；-80℃超低溫冰箱、Centrifuge5810R離心機（Eppendorf Research），倒置顯微鏡（Leica），Chemvak負壓吸液器（上海人和科學儀器），酶聯(lián)免疫檢測儀（Biotek），BD FACS Calibur流式細胞儀（碧迪醫(yī)療器械）。

1.3 方法

1.3.1 MTT法測柳蘑多糖對HaCat細胞增殖的影響 收集對數(shù)期生長HaCat細胞，將細胞以每孔約8 000個細胞，鋪于96孔板中，按每個濃度設6個復孔，共設有6個濃度梯度（1 000 mg/L,100 mg/L, 10 mg/L,1 mg/L,0．1 mg/L,0．01 mg/L），同時設空白組（無細胞組）和對照組（溶劑組），也設6個復孔，共計48個孔，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基補至100 μL，邊緣孔用PBS填充，移入CO2培養(yǎng)箱（37℃，飽和濕度，5%CO2）培養(yǎng)；細胞貼壁后，吸棄每孔上清，加入事先配好的各濃度梯度的柳蘑多糖和DMEM完全培養(yǎng)基混懸液100 μL，空白組加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，對照組加入ddH2O和DMEM完全培養(yǎng)基混懸液，移入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；分別在24 h和48 h后加入20 μL MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，使結(jié)晶紫充分溶解，室溫放置約10 min后，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490處測各孔吸光值。

1.3.2 Annexin V-PI染色法測定柳蘑多糖刺激HaCaT細胞后的凋亡情況 收集對數(shù)期生長HaCat細胞，計數(shù)后，以每孔約2×105個鋪于六孔板中，設陰性對照組（加溶劑，加FITC和PI染料）、藥物組（加適當濃度藥物及FITC和PI染料），待細胞貼壁后，陰性對照組加入ddH2O水，藥物組加入配好的藥物，移入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集細胞（用不含EDTA的胰酶消化細胞，并要防止消化過度），將各孔的細胞團塊用PBS洗滌2次，每孔加入250 μL binding buffer重懸細胞，移入1．5 mL EP管內(nèi)，每管各取150 μL，再分別加入3個新的1．5 mL EP管中，每管100 μL，3孔分別為空白組、FITC單染孔、PI單染組。每管加入400 μL binding buffer補足至500 μL，避光分別加入5 μL FITC和PI，空白組不加染料，F(xiàn)ITC單染孔加FITC染料，不加PI染料，PI單染組加PI染料，不加FITC染料，室溫避光孵育10 min，將每管細胞移入流式管內(nèi)（用黃膜過濾），用流式細胞儀收集10 000個細胞。以上實驗重復3遍，取平均值。

1.3.3 PI法測定應用 柳蘑多糖刺激HaCaT細胞后的周期情況HaCat細胞鋪板及加藥收集處理同

1.3.2 ，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，再用PBS重懸細胞，取2個10 mL離心管，每管加入4 mL事先配制好的70%乙醇溶液，將1 mL PBS重懸的細胞，緩慢加入乙醇溶液中，放入-20℃，固定2 h以上。取出固定好的細胞，2 000 r/min，5 min離心，棄上清，用PBS洗滌細胞2次，得到細胞團塊后，用500 μL 1×PI重懸細胞，室溫孵育20 min，將每管細胞移入流式管內(nèi)（用黃膜過濾），用流式細胞儀收集10 000個細胞。以上實驗重復3遍，取平均值。

1.3.4 ELISA法檢測柳蘑多糖對rhIFN-γ活化的HaCat細胞分泌ICAM-1和IL-8的影響 取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的HaCaT細胞,經(jīng)消化液消化細胞,離心5 min后計數(shù),以2×105/孔接種于六孔板（對照組，空白組，藥物組）,加入500 U/mL rhIFN-γ刺激培養(yǎng)細胞24 h后，分別用ddH2O（對照組）、待測藥物（藥物組）處理48 h后，收集細胞上清，4℃，1 000 r/min，離心10 min，棄沉淀得到細胞上清待用。按試劑盒說明配制1×洗液、1×檢測緩沖液、檢測抗體，重溶人ICAM-1（IL-8）標準品，制作標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各組細胞上清中ICAM-1（IL-8）的含量。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測柳蘑多糖對HaCat細胞增殖的影響柳蘑多糖在濃度為10～0．01 mg/L，時間為24 h或48 h時，對HaCat細胞的增殖均有抑制作用，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），但柳蘑多糖在濃度為0．1 mg/L，作用時間為48 h時，對HaCat細胞增殖的抑制作用最強，所以筆者后續(xù)實驗選擇作用濃度為0．1 mg/L，作用時間為48 h。見表1，圖1。

表1 柳蘑多糖對HaCat細胞增殖的影響（24 h和48 h）（s）

表1 柳蘑多糖對HaCat細胞增殖的影響（24 h和48 h）（s）

注：與對照組相比，*P＜0．05*，**P＜0．01，***P＜0．001。

增殖率（%） 抑制率（%）對照（24 h） 0．639±0．044 10 mg/L（*）（24 h） 0．546±0．028 85．4 14．6 1 mg/L（*）（24 h） 0．566±0．017 88．6 11．4 0．1 mg/L（**）（24 h） 0．493±0．023 77．2 22．8 0．01 mg/L（**）（24 h） 0．500±0．028 78．2 21．8對照（48 h） 0．761±0．070 10 mg/L（***）（48 h） 0．410±0．064 53．9 46．1 1 mg/L（***）（48 h） 0．387±0．010 50．9 49．1 0．1 mg/L（***）（48 h） 0．337±0．032 44．3 55．7 0．01 mg/L（***）（48 h） 0．358±0．017 47．0 53．0組別 A490（s）

圖1 柳蘑多糖對HaCat細胞增殖的影響

2.2 Annexin V-PI染色法測定柳蘑多糖刺激HaCaT細胞后的凋亡情況 濃度為0．1 mg/L的柳蘑多糖對HaCat細胞的凋亡產(chǎn)生影響，使凋亡晚期細胞增多，凋亡早期細胞減少，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。因此，柳蘑多糖可以促進HaCat細胞的凋亡，且意義可能為促進早期凋亡過渡至晚期凋亡。見圖2～4。

圖2 對照組凋亡情況

圖3 0.1 mg/L組凋亡情況

圖4 柳蘑多糖對HaCat細胞凋亡的影響

表2 柳蘑多糖對HaCat細胞凋亡的影響 （s）

表2 柳蘑多糖對HaCat細胞凋亡的影響 （s）

注：與對照組相比，***P＜0．001。

組別 凋亡晚期（Q2） 凋亡早期（Q3） 總凋亡（Q2＋Q3）對照組 4．02±0．120 0．63±0．008 4．66±0．116 0．1 mg/L（***） 8．73±0．096 0．48±0．007 9．22±0．099

2.3 PI法測定應用 柳蘑多糖刺激HaCaT細胞后的周期情況 濃度為0．1 mg/L的柳蘑多糖可以影響HaCaT細胞的細胞周期，且是對細胞DNA合成期有影響，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），但對細胞DNA合成前期（G1期）及DNA合成后期（G2期）無影響，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表3，圖5～7。

圖5 對照組細胞周期情況

圖6 0.1 μg/mL組細胞周期情況

2.4 ELISA法檢測 柳蘑多糖對rhIFN-γ活化的HaCat細胞分泌ICAM-1和IL-8的影響HaCat細胞可自發(fā)分泌ICAM-1和IL-8，經(jīng)rhIFN-γ刺激后，HaCat細胞的ICAM-1和IL-8分泌量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且濃度為0.1 mg/L的柳蘑多糖對活化后的HaCaT細胞分泌的ICAM-1和IL-8有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4，圖8、9。

圖7 細胞周期占比比較

表3 柳蘑多糖對HaCat細胞細胞周期的影響（s，%）

表3 柳蘑多糖對HaCat細胞細胞周期的影響（s，%）

注：與對照組相比，*P<0.05。

柳蘑多糖濃度DNA合成期占比對照組 35.87±0.22 15.90±0.29 48.23±0.51 0.1 mg/L 36.83±0.62 16.13±0.11 47.04±0.52* DNA合成前期占比DNA合成后期占比

表4 柳蘑多糖對ICAM-1及IL-8分泌的影響 （s）

表4 柳蘑多糖對ICAM-1及IL-8分泌的影響 （s）

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.001。

已活化 柳蘑多糖濃度IL-8分泌濃度（pg/mL）對照組 2 353.01±86.27 3 305.40±88.73 0.1 mg/L 1 678.48±85.64* 1 922.14±69.89**未活化 123.84±34.56** 131.80±25.84** ICAM-1分泌濃度（pg/mL）

3 討論

圖8 柳蘑多糖對ICAM-1分泌的影響

圖9 柳蘑多糖對IL-8分泌的影響

銀屑病是一種臨床常見的以KC過度增生為特點的炎癥性皮膚病，其患者具有特征性的紅色丘疹、斑塊，上覆銀白色鱗屑，有點狀出血，表現(xiàn)出角化過度、角化不全、顆粒層消失及棘層肥厚的病理改變[8]。銀屑病的確切病因及發(fā)病機理尚未完全清楚，但目前多數(shù)學者認為銀屑病是一種T細胞介導的自身免疫性疾病，由活化T細胞產(chǎn)生的細胞因子（如γ-干擾素）刺激KC增殖，而增殖的KC又能釋放出其他細胞因子（如IL-8、ICAM-1），進一步增強活化的T細胞的作用，形成一種正反饋調(diào)節(jié)[1-3]。KC不僅可作為免疫反應的靶細胞,而且可以通過表面分子及分泌的細胞因子等作用于皮損中浸潤的炎細胞,尤其是T細胞,對其活性、功能及增殖能力等產(chǎn)生影響，而由IFN-γ等細胞因子誘導KC產(chǎn)生的IL-8、ICAM-1等細胞因子增強皮損中細胞的活化狀態(tài),這些都充分顯示KC在銀屑病的發(fā)病機制中主動參與了免疫紊亂過程[9-11]。因此KC的增殖為銀屑病至關重要的致病因素，抑制其異常增殖是治療銀屑病的一種方法。IFN-γ是Thl淋巴細胞分泌的重要細胞因子之一,是調(diào)節(jié)皮膚炎癥和免疫反應的最有效的促炎因子,對KC有活化作用,并可使KC表達許多趨化因子、細胞因子和膜分子,進一步級聯(lián)放大了炎癥反應[12]。多形核中性粒細胞聚集至表皮是通過IL-8的趨化作用來實現(xiàn)的，而KC與炎性細胞間的黏附是由ICAM-1實現(xiàn)的，這3種細胞因子在T細胞與KC之間形成一種橋梁，使二者可以相互影響，相互作用[9]。筆者研究結(jié)果顯示用IFN-γ刺激KC（HaCaT細胞），可以使KC（HaCaT細胞）分泌的ICAM-1及IL-8水平顯著升高，具有活化KC（HaCaT細胞）的作用。皮膚中浸潤的T細胞分泌的IFN-γ誘導KC表面ICAM-1表達,促進KC與淋巴細胞間的相互作用,同時促進白細胞移入表皮。IL-8能促進中性粒細胞、淋巴細胞趨化，同時也是KC的促生長因子，可加速表皮增殖，其主要的生物學功能是在炎癥反應中趨化中性粒細胞和T細胞向表皮浸潤，引起局部炎癥反應[13]。

而柳蘑軟膏是一種外用的柳蘑為主要成分的藥膏，已上市多年，根據(jù)長期臨床療效觀察，柳蘑軟膏治療輕中度銀屑病有一定的療效[3]，但具體作用機制尚未得到探討。柳蘑軟膏主要成分是柳蘑，柳蘑又名又黃傘、黃蘑，是8～10月份群生于闊葉樹的蛀眼或倒木上，尤其是柳樹上居多的一種北方特有的野生珍稀食用菌。其主要成分為柳蘑多糖，柳蘑多糖可以抑制體外培養(yǎng)的成纖維細胞株，有一定的抗增生作用，并且有抗微生物作用，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、結(jié)核分枝桿菌等有較強的抗菌活性；同時，柳蘑多糖還有較強的還原性及抗氧化活性[4-6]。另外，還有文獻表明，柳蘑多糖具有免疫增強作用，其對小鼠腹腔巨噬細胞的激活效應研究證明，其能有效地激活巨噬細胞，通過增強細胞因子分泌、增強NO的產(chǎn)生水平、增強其吞噬功能及體外殺傷活性等多種途徑來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，并可起到抑制腫瘤的生長效應[7]。而本實驗研究證實，柳蘑多糖可以對HaCaT細胞造成影響，其作用機制是通過抑制KC增殖，促進KC凋亡，改變KC的細胞周期及細胞因子（IL-8,ICAM-1）分泌這4個方面實現(xiàn)的，從KC的角度初步探討了柳蘑軟膏治療銀屑病的分子及細胞機制，但本實驗尚未涉及柳蘑多糖對免疫細胞（如T淋巴細胞）的影響，這也是筆者今后工作會繼續(xù)的方向。

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Effects of Pholiota Adiposa Polysaccharide on Keratinocytes

Song Jingxin1,Dong Cun2,Zhang Litao3,Wang Jin3,Wang Xi4
1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Tianjin Darentang Jingwanhong Pharmaceutical Co.,Ltd,Tianjin 300112,China;3.Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, Tianjin 300120,China;4.Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

ObjectiveIn order to investigate the influence of pholiota adiposa polysaccharide on keratinocytes(HaCat cells) and its possible mechanism.Method MTT method was used to detect proliferation situation of HaCaT cells that stimulated by pholiota adiposa polysaccharides;Annexin V-PI staining method was used to detect apoptosis situation of HaCaT cells that stimulated by pholiota adiposa polysaccharides;PI method was used to detect the cell cycle’s change of HaCaT cells that stimulated by pholiota adiposa polysaccharides;rhIFN-γ was used to active HaCaT cells,then the pholiota adiposa polysaccharides was added to detect the excretion of IL-8 and ICAM-1(ELISA method).ResultsThe MTT method proved that pholiota adiposa polysaccharide inhibited the proliferation of HaCaT cells;the best inhibiting concentration was 0.1 g/mL; and the best action time was 48 h.The Annexin V-PI staining method proved that pholiota adiposa polysaccharide promoted the apoptosis of HaCaT cells.The PI method proved that pholiota adiposa polysaccharide could effected on the HaCaT cells cycle(cells’DNA synthesis phase).The ELISA method proved that HaCaT cell excreted IL-8 and ICAM-1 increasing significantly after activated by rhIFN-γ,on the contrary,pholiota adiposa polysaccharide could reduce the excretion of IL-8 and ICAM-1 by activated HaCaT cells.ConclusionPholiota adiposa polysaccharide could affected on keratinocytes(HaCaT cells).And the mechanism is possibly by inhibiting the proliferation of keratinocytes,promoting the apoptosis of keratinocytes, changing the cell cycle of keratinocytes and the excretion of cytokines(IL-8 and ICAM-1).

Pholiota adiposa polysaccharide;HaCaT cell；Psoriasis

R331

A

1672－0709（2016）06-0331－05

2016-03-22）