趙雅楠，王穎，2，張東杰，沈琰，楊義杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學）

基于SSR技術的水稻DNA指紋圖譜構建

趙雅楠1，王穎1，2，張東杰1，沈琰1，楊義杰1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學）

水稻是我國重要的糧食作物，具有種植面積大、分布范圍廣等特點，然而由于水稻的遺傳基礎比較狹窄，在新品育種、品種區(qū)分及質量監(jiān)控等方面經(jīng)常出現(xiàn)問題。SSR技術作為第二代分子標記的典型代表，具有標記數(shù)量豐富、定位精準等優(yōu)點，在水稻SSR指紋圖譜的構建中提到不可替代的重要作用。該文主要綜述了基于SSR技術構建的水稻DNA指紋圖譜，對其技術要點及其構建意義進行分析，并對其發(fā)展趨勢進行展望。

SSR技術；水稻；DNA指紋圖譜

“民以食為天”體現(xiàn)出人類與糧食作物的密切關系，水稻作為我國最重要的糧食作物，與人們的生活密不可分。近些年，我國水稻種植大面積推廣，隨著水稻產(chǎn)量的大幅度提高，一系列問題也接踵而來，假冒偽劣稻米以次充好、新品育種難度大、雜種優(yōu)勢不明顯等都制約著我國水稻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，研究快速、準確的品種鑒定技術，為水稻的遺傳多樣性分析及種質資源鑒定等提供依據(jù)迫在眉睫。“DNA指紋”的概念由英國遺傳學家Jefferys在1985年第一次提出，正式將“指紋”一詞引入到現(xiàn)代分子生物學中[1]，隨后DNA指紋圖譜技術應運而生。SSR技術作為第二代分子標記的典型代表，具有數(shù)量豐富、定位準確等特點，是一種較為理想的分子標記技術，在水稻DNA指紋圖譜的構建過程中起到不可替代的重要作用。

1 DNA指紋圖譜技術及分類

DNA指紋圖譜是指在DNA水平上建立像人類指紋一樣具有特異性、可以區(qū)別品種及個體間差異的圖譜，標記數(shù)量多，不受外界環(huán)境及作物發(fā)育階段的影響，多態(tài)性高，結果穩(wěn)定、可靠，且操作簡單，自動化程度高，提取出的DNA樣品可以保存較長時間，適用于仲裁性或者溯源性鑒定[2-5]。目前，DNA指紋圖譜技術可以分為RFLP、RAPD、AFLP、SSR四類。

RFLP標記由Grodzicker等創(chuàng)立于1975年，是研究最早的一類分子標記技術，標記數(shù)量大，可以區(qū)別純合型基因或者雜合型基因，但操作復雜，費用昂貴，需要使用放射性同位素，有害人體健康[6-8]，因此限制了其在DNA指紋圖譜中的應用；RAPD標記由Williams和Welsh在1990年創(chuàng)立，靈敏度高，檢測成本低，只需要少量的DNA樣品即可，但存在基因遷移的可能性，因此重復性較差[9-11]；AFLP標記由Zabeau在1993年創(chuàng)立，是一類與PCR技術緊密結合的分子標記技術，具有較好的重現(xiàn)性，適用范圍廣，但是試劑盒價格昂貴，實驗成本高，要求提取出的DNA純度極高，實驗人員的工作難度較大，此外，AFLP技術已經(jīng)被一些國家申請專利，因此該技術在商業(yè)及生產(chǎn)上的應用推廣存在一定的限制性[12-15]。

SSR又稱微衛(wèi)星序列，是在真核生物中普遍存在的一段由1-6個堿基組成的重復序列，大約每10～50 kb就存在一個微衛(wèi)星[16-18]。SSR技術主要利用基因中SSR序列兩端具有保守性的特點為其設計引物，經(jīng)PCR擴增后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳或者濃度較高的瓊脂糖凝膠電泳以分析DNA的多態(tài)性。SSR標記與PCR技術緊密結合，是當前應用時間最長，涉獵范圍最廣的新型DNA標記技術，具有結果重復性好、可信度高、操作簡便，成本低等特點。與此同時，目前有一部分作物的SSR序列已經(jīng)公布，可以供人們直接使用，并且隨著SSR位點的不斷開發(fā)，該技術必將成為作物品種鑒定、指紋圖庫構建等領域的中堅力量[19]。

2 SSR標記技術要點

SSR技術具有操作簡單、遺傳信息完整、結果可信度高等特點，廣泛應用于水稻的DNA指紋圖譜構建之中。水稻SSR指紋圖譜構建主要經(jīng)過核心SSR引物篩選、DNA提取、PCR擴增、產(chǎn)物分離等步驟[20]。

2.1 SSR引物的獲取

SSR引物是兩段人工合成的寡核苷酸序列，PCR的過程中在特定位置與目的DNA互補，充當核苷酸在聚合反應時的起始點。傳統(tǒng)的水稻SSR引物獲取方法是在NCBI、DDBJ、EMBL等數(shù)據(jù)庫檢索，近些年，隨著二代測序時代的到來，水稻SSR引物的開發(fā)也有了新突破。二代測序技術具有高通量、低成本、簡單便捷等特點，可以將龐大、復雜的水稻基因組簡化，通過分析基因組中個別具有代表性的小DNA片段進而探索整個基因組特征，其中比較常見的是RAD-seq技術。該技術利用限制性內切酶對DNA進行處理，對獲得的小片段建庫、測序，最后檢索出片段中的SSR位點。Sun等[21]利用兩種不同的限制性內切酶對水稻基因組進行處理，得到25 000個DNA片段，采用Illumina GAⅡ讀取其中90%的片段，占該水稻全基因組的82%，讀取的重復片段為19%，證明簡化基因組應用于水稻種質研究中是可行的。

2.2 DNA提取

水稻的DNA提取是構建SSR指紋圖譜的基礎工作，在提取的過程中要盡可能的保證DNA的完整性，在避免受到有機溶劑、金屬離子以及其它核酸分子污染的基礎上，將蛋白質、多糖以及酚類等含量降低。目前常用的DNA提取法主要包括CTAB法、SDS法、DNA試劑盒提取法和磁珠法核酸純化法等。SDS法操作步驟少，操作簡單快捷，但主要是針對蛋白質含量較多的作物，不適用于水稻的提??；磁珠法核酸純化技術自動化程度高，可以減少手工操作程序，但目前很少應用于植物DNA提取中。DNA試劑盒可以避免使用酚和氯仿，安全可靠且提取率高，但操作煩瑣，成本較高，其中CTAB法是目前應用最多的DNA提取方法。趙國珍等[22]開發(fā)出一種高效的水稻DNA提取方法，成本較低，提取一份樣品只需0.1元，操作快捷，每小時可完成近百個樣品的提取，設備要求低，可直接提取水稻干種子，特別適合水稻SSR研究。Wang等[23]開發(fā)出一種以超聲波溫育為前處理的CTAB法提取水稻DNA，發(fā)現(xiàn)該法提取質量和提取效率都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

2.3 聚合酶鏈式反應

PCR（聚合酶鏈式反應）是上個世紀80年代產(chǎn)生，用于擴增特定DNA的分子生物學技術。其原理主要是利用DNA在95℃的體外環(huán)境下會變成單鏈，在60℃時可以與引物結合，在70℃左右時可以使DNA聚合酶合成互補鏈，可完成DNA擴增的特點。SSR-PCR體系中含有較多的影響因子，如DNA模板濃度、Taq DNA聚合酶濃度、dNTPs濃度、退火溫度等都對PCR擴增效果的影響十分明顯[24-26]，因此通常都要進行PCR條件的探索和優(yōu)化，探究同一PCR體系下各個影響因子的最佳配比。近些年，隨著分子生物學的不斷發(fā)展，SSR-PCR技術也得到優(yōu)化，逐漸向操作簡便、快捷高效的趨勢發(fā)展。羅天寬[27]等研究出一種應用水稻葉片直接PCR的方法，省去了DNA的提取過程，直接以葉片為模板，加入0.8%PCR增強劑，發(fā)現(xiàn)檢測效果與傳統(tǒng)PCR差異不顯著。魏霜等[28]對水稻的多重PCR反應進行研究，成功建立了七重PCR體系，發(fā)現(xiàn)相較于單一PCR體系，多重PCR檢測速度快，效率高，結果準確。

2.4 產(chǎn)物分離

PCR產(chǎn)物分離是SSR技術中難度較大的關鍵環(huán)節(jié)，對后續(xù)的數(shù)據(jù)處理、結果分析等起到重要作用。目前在水稻SSR指紋圖譜構建中常用的分離技術主要包括瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光標記毛細管電泳檢測法。瓊脂糖凝膠電泳可分離分子量在0.2～20 kb范圍內的DNA分子，操作簡便，不需預處理，可直接在紫外光下觀察條帶情況[29]，但在制膠過程中需要使用具有致癌性的溴化乙錠，有害人體健康，且瓊脂糖的分辨率不高，在引物篩選及品種鑒定方面效果不佳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離分子量在1～500 bp的核苷酸片段，其分辨率高于瓊脂糖凝膠，但仍不能準確讀取DNA片段的大小，易出現(xiàn)誤讀，且操作復雜，檢測耗時長、效率低，不適合大規(guī)模、多批次的處理樣品[30]。熒光標記毛細管電泳檢測法是一種高效、精準的檢測技術，能夠識別1～2個堿基片段之間的差異，是目前較先進的產(chǎn)物分離技術。程本義[31]等以16份雜交水稻為模板建立SSR熒光標記體系，發(fā)現(xiàn)熒光標記毛細管電泳檢測技術數(shù)據(jù)精準，結果可靠，檢測效率和質量俱佳。

3 SSR標記的優(yōu)勢與不足

SSR標記作為第二代分子標記技術的典型代表，較于其他分子標記技術具有十分突出的優(yōu)點。首先，SSR標記以核酸為研究單位，能夠在DNA水平上評價個體或種群之間的差異，不受周圍環(huán)境、采樣時間、DNA來源組織或器官的影響，不涉及基因是否表達等問題。其次，植物中的SSR數(shù)量豐富，分布廣泛，能夠開發(fā)的標記幾乎是無限的。第三，SSR標記符合孟德爾定律，呈共顯性，能夠區(qū)分純合型或雜合型基因。最后，SSR標記對DNA純度及數(shù)量要求不高，即使部分DNA降解也可以完成分析[32-36]。由此可見，SSR標記的優(yōu)越性十分明顯，但同時也存在一定的局限性。首先，由于SSR的進化具有不確定性，DNA分子的突變機理及突變方向仍飽受爭議，尚未探究清楚，需要根據(jù)不同品種設計不同的特異性引物。其次，部分SSR標記位點與功能位點存在不同程度的差異，這種不一致使分子標記與目的基因之間存在一定的遺傳距離，進而會在后續(xù)的分子輔助選擇中出現(xiàn)一定的不準確。最后，由于SSR技術起步較晚，有很多與控制重要農(nóng)藝形狀目的基因相關聯(lián)的分子標記還沒有準確定位，這在一定程度上影響了分子標記的質量[37-39]。

4 展望

SSR標記具有多態(tài)性豐富、操作簡單等優(yōu)點，在水稻的種質資源鑒定、遺傳多樣性分析等領域體現(xiàn)出重要應用價值?；赟SR技術構建水稻DNA指紋圖譜是分子標記技術迅速發(fā)展的標志，是快速、準確鑒定常規(guī)水稻真實性及純度的重要技術體系，是保護稻米種權、拓寬水稻遺傳基礎的必經(jīng)之路。隨著水稻基因組測序工作的快速推進，越來越多的滿足SSR標記的等位基因位點將會呈現(xiàn)在人們面前。此外，熒光素標記法、毛細管電泳技術等也逐漸成熟，對水稻SSR指紋圖譜的應用起到巨大推動作用。毋庸置疑，水稻SSR指紋圖譜技術的不斷發(fā)展必然會為水稻的基因組研究、品種真?zhèn)舞b定、遺傳分析等提供有力支持，因此，水稻SSR指紋圖譜意義重大，值得大力推廣。

［1］梅洪娟，馬瑞君，莊東紅.指紋圖譜技術及其在植物種質資源中的應用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2014（3）：159-164.

［2］許彥.水稻品種SSR指紋身份證系統(tǒng)的建立［D］.福州：福建農(nóng)林大學，2010.

［3］Singh A K，Singh P K，Arya M，et al.Molecular Screening of Blast Resistance Genes in Rice using SSR Markers.［J］. Plant Pathology Journal，2015，31（1）：12-24.

［4］Singh H，Deshmukh R K，Singh A，et al.Highly variable SSR markers suitable for rice genotyping using agarose gels［J］.Molecular Breeding，2010，25（2）：359-364.

［5］何琳，何艷琴，劉業(yè)麗，等.長江流域片國家區(qū)試大豆品種分子ID構建及遺傳多樣性分析［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2014，26（3）：5-9.

［6］劉海珍.粳稻主要親本SSR指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2009.

［7］吳鑫.柑桔DNA指紋圖譜庫的構建與分析［D］.重慶：西南大學，2008.

［8］Sarao N K，Vikal Y，Singh K，et al.SSR marker-basedDNA fingerprinting and cultivar identification of rice（O－ryza sativa L.）in Punjab state of India［J］.Plant Genetic Resources，2010，8（1）：42-44.

［9］Saker M M，Youssef S S，Abdallah N A，et al.Genetic analysis of some Egyptian rice genotypes using RAPD，SSR and AFLP［J］.African Journal of Biotechnology，2011，4（9）：882-890.

［10］李溪盛.北方粳稻DNA指紋圖譜的構建［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學，2014.

［11］尤佳，王晉，文朝慧，等.應用SSR技術鑒定雜交種種子純度的方法探究［J］.種子，2015，34（5）：46-49.

［12］張玉翠，楊偉華，匡猛，等.SSR分子標記在棉花研究中的應用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（3）：1321-1323.

［13］曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米SSR分子標記技術操作流程研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2012，28（15）：1-4.

［14］Chakanda R，Treuren R V，Visser B，et al.Analysis of genetic diversity in farmers’rice varieties in Sierra Leone using morphological and AFLPmarkers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2013（60）：1237-1250.

［15］Hengmei H，Zakaria L，Salleh B.Characterization of Fusarium Isolates From Rice，Sugarcane and Maize Using RFLP-IGS［J］.Journal of Plant Protection Research，2010，50（4）：409-415.

［16］鄧姍，褚云霞，黃志城，等.上海地區(qū)水稻已知品種SSR指紋圖譜庫構建［J］.中國農(nóng)學通報，2015，31（3）：7-15.

［17］郭奕生，陸俊，郭奕南.利用SSR分子標記鑒定水稻品種真實性［J］.種子，2014，33（6）：115-118.

［18］Shu A P，Liu Z B，Yu L Q，et al.Research Progress on Genetic Diversity Development in Rice by SSR［J］.Journal of Plant Genetic Resources，2013，14（5）：778-783.

［19］Zhang Y.Analysis of SSR Marker-based Polymorphism of Pigmented Rice in Shaanxi［J］.Editorial Office of Journal of Plant Genetic Resources，2011，12（5）：10-13.

［20］牛付安，程燦，周繼華，等.分子標記在雜交粳稻育種上的應用現(xiàn)狀及展望［J］.中國稻米，2015，21（1）：18-23.

［21］Xiaowen S，Dongyuan L，Xiaofeng Z，et al.SLAF-seq：an efficient method of large-scale de novo SNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing［J］. Plos One，2013，8（3）：e58700.

［22］趙國珍，賈育林，嚴宗卜，等.一種高效便捷的水稻DNA提取法及其應用［J］.中國水稻科學，2012，26（4）：495-499.

［23］Wang Z C.Extraction of rice seed DNA by ultrasonic treatment［J］.Journal of Fujian Agriculture&Forestry U－niversity，2015，44（5）：449-455.

［24］Priya A，Das S P，Goswami S，et al.An exploratory study on allelic diversity for five genetic loci associated with floral，organ development in rice［J］.American Journal of Plant Sciences，2015（6）：1973-1980.

［25］程江，鄭常祥.水稻SSR-PCR的反應體系優(yōu)化及RIL親本間多態(tài)性引物篩選［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2013，41 （4）：10-13.

［26］李炫麗，王世才，許雙全.水稻單粒種子DNA提取及SSR-PCR反應體系的正交設計優(yōu)化［J］.種子科技，2011，29（6）：20-23.

［27］羅天寬，張小玲，朱世楊，等.應用水稻葉片直接PCR擴增的方法［J］.分子植物育種，2015，13（11）：2590-2592.

［28］魏霜，陳貞，蘆春斌，等.多重PCR檢測轉基因水稻的轉基因成分［J］.食品科學，2012（12）：159-162.

［29］Wankhade S D，Cornejo M J，Mateu-Andres I.Microsatellite marker-based genetic variability in Spanish rice cultivars and landraces［J］.Spanish Journal of Agricultural Research，2010，8（4）：995-1004.

［30］Xie X J，Bing-Bai L I，Wang L，et al.Spatial and Temporal Distribution of High Temperature and Strategies to Rice Florescence Harm in the Lower-middle Reaches of Yangtze River［J］.Chinese Journal of Agrometeorology，2010，31（1）：144-150.

［31］程本義，夏俊輝，龔俊義，等.SSR熒光標記毛細管電泳檢測法在水稻DNA指紋鑒定中的應用［J］.中國水稻科學，2011，25（6）：672-676.

［32］Singh A K，Singh P K，Madhuri A，et al.Molecular Screening of Blast Resistance Genes in Rice using SSR Markers ［J］.Plant Pathology Journal，2015，31（1）：12-24.

［33］鐘育海，鄭小江，秦光才，等.恩施州遲熟組水稻新品種試驗鑒定與評價［J］.湖北民族學院學報：自然科學版，2015（4）：430-434.

［34］束愛萍，劉增兵，余麗琴，等.水稻SSR標記的遺傳多樣性研究進展［J］.植物遺傳資源學報，2013，14（5）：778-783.

［35］Jin L，Lu Y，Xiao P，et al.Genetic diversity and population structure of a diverse set of rice germplasm for association mapping［J］.Tag.theoretical&Applied Geneticstheoretische Und Angewandte Genetik，2010，121（3）：475-487.

［36］張蕾，于永昂，楊天佑.小麥TaXRCC1基因的克隆及生物信息學分析［J］.河南科技學院學報：自然科學版，2015，43（6）：1-7.

［37］朱巖芳.作物品種分子標記鑒定及指紋圖譜構建研究［D］.杭州：浙江大學，2013.

［38］尤佳，王晉，文朝慧，等.應用SSR技術鑒定雜交種種子純度的方法探究［J］.種子，2015，34（5）：46-49.

［39］任輝.SSR分子標記在雜交水稻品種純度鑒定中的應用研究［D］.杭州：浙江農(nóng)林大學，2013.

Fingerprint Construction of Rice DNA Based on the SSR Molecular Marker Technology

Zhao Yanan1，Wang Ying1，2，Zhang Dongjie1，Shen Yan1，Yang Yijie1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy）

Rice was one of the most important crops in China，with large planting area，and wide geographical distribution scope. However，for the narrow genetic basis，problems always emerged in new variety breeding，quality control and other aspects of distinction.SSR technology typically presented the 2nd generation of molecular marking，had the advantages of large amount，spicific location plays an irreplaceable role in SSR fingerprint construction.The article reviewed the recent development of DNA fingerprint construction based on SSR technology.Key technology elements and significance of fingerprint construction，and new trend of this area was also discussed.

SSR；rice；DNA fingerprint

S511

A

1002-2090（2016）05-0032-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.006

2015-09-28

“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃項目（2012BAD34B02）；黑龍江省應用技術與開發(fā)重大項目（GA14B104）；黑龍江省農(nóng)墾總局“十二五”重點科技計劃項目（高產(chǎn)金屬硫蛋白菌株的選育及其高效純化技術研究：HNK125B-13-05）；大慶科技局創(chuàng)新項目（雜糧及其深加工分析測試技術平臺建設：sjh-2013-65）。

趙雅楠（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院2015級碩士研究生。

張東杰，男，教授，博士研究生導師，E-mail：byndzdj@126.com。