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AQP1、AQP5、AQP8和mRNA在羊水量異?;颊咧械谋磉_與意義

2016-03-06 12:58張雅石紫云白潤芳
海南醫(yī)學(xué) 2016年19期
關(guān)鍵詞:胎膜羊水水量

張雅,石紫云,白潤芳

(陜西省人民醫(yī)院產(chǎn)科,陜西 西安 710038)

AQP1、AQP5、AQP8和mRNA在羊水量異?;颊咧械谋磉_與意義

張雅,石紫云,白潤芳

(陜西省人民醫(yī)院產(chǎn)科,陜西 西安 710038)

目的 探討水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白5(AQP5)、水通道蛋白8(AQP8)與羊水量調(diào)節(jié)的相關(guān)性,以期闡明羊水量異常的分子細胞病理學(xué)機制。方法收集我院2012年1月至2015年12月行剖宮產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦120例,其中特發(fā)性羊水量過少組40例、過多組40例和羊水量正常組40例,采用Western blotting和Q-PCR檢測AQP1、AQP5、AQP8蛋白和mRNA的表達,統(tǒng)計分析與其羊水異常的相關(guān)性。結(jié)果相對于正常組,羊水過少組中AQP1的mRNA表達為下調(diào),但AQP1的蛋白表達卻為上調(diào),反之在羊水過多組中AQP1的mRNA為上調(diào),蛋白的表達卻為下調(diào),其組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);羊水過多組與過少組中AQP5的mRNA表達均為下調(diào),且蛋白表達均為下調(diào),其組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);羊水過少組AQP8的mRNA表達均為下調(diào),蛋白表達卻為上調(diào),但羊水過多組中AQP8的mRNA為上調(diào),蛋白的表達卻為下調(diào),其組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論AQP1和AQP8蛋白的低表達可能會造成羊水吸收減少而導(dǎo)致羊水過多,AQP5蛋白的表達下調(diào)可能會引起羊水代謝的異常而導(dǎo)致羊水量異常。

水通道蛋白;mRNA;羊水量;異常;相關(guān)性

羊水是保護胎兒的重要成分,羊水的98%是水,其成分主要是來自母體血漿通過胎膜透析羊膜的上皮細胞分泌和胎兒的尿液,另外含有少量無機鹽類、有機物荷爾蒙和脫落的胎兒細胞。正常妊娠時羊水的產(chǎn)生與吸收是動態(tài)平衡的過程,引起羊水產(chǎn)生或吸收的失衡的任何因素均可造成羊水過多或過少,羊水量異常是產(chǎn)科常見的疾病之一,其發(fā)病機制有待闡明,尚無有效的防治措施。近年來由于羊水量異常引起胎兒異常的發(fā)病率、死亡率明顯升高[1]。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)又名水孔蛋白,是一類位于細胞膜上的蛋白質(zhì)(內(nèi)在膜蛋白),在哺乳動物中至少存在13種(AQP0~AQP12)水通道蛋白家族成員,在細胞膜上組成“孔道”,精細參與調(diào)節(jié)細胞跨膜的滲透平衡。已有研究報道AQPs在人胎盤及胎膜組織中表達[2-3],并參與母體與胎兒間的液體交換,且與羊水量的調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)[4-5]。本研究通過分別檢測水通道蛋白1 (AQP1)、水通道蛋白5(AQP5)、水通道蛋白8(AQP8)在羊水量異常的足月孕婦胎膜中的表達,探討AQP1、AQP5、AQP8與羊水量調(diào)節(jié)的相關(guān)性,以期闡明羊水量異常的分子病理機制,為尋找羊水量異常的治療方法有較為深遠的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院產(chǎn)科2012年1月至2015年12月收治的行剖宮產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦120例,其中特發(fā)性羊水量過少、過多和羊水量正常組各40例。所有產(chǎn)婦均為單胎,足月妊娠,無妊娠藥物服用史及縮宮素引產(chǎn)史,年齡22~34歲,排除胎膜早破、胎盤異常、胎兒畸形、妊娠期糖尿病、高血壓、及其他可能會影響羊水量異常的并發(fā)癥和合并癥。三組研究對象的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 診斷標準 通過B超測量分娩前羊水最大暗區(qū)垂直深度(AFV)來評估羊水量,AFV≤2 cm為羊水量過少,AFV≥8 cm為羊水量過多。實際羊水量測算方法為:首先是收集羊水和混合液總量,其次是測定混合液中的紅細胞壓積值(HCT),再次通過公式計算羊水量。羊水量計算公式為:實際羊水量=羊水和混合液總量-羊水中血量,羊水中血量=羊水和混合液總量×羊水中HCT/產(chǎn)前血HCT×100%。其中羊水量>2 000 mL為羊水量過多,<3 00 mL為羊水量過少,3 00 mL≤羊水量≤2 000 mL為羊水量正常[6]。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本收集 當(dāng)胎盤娩出后立刻取胎膜組織,剪成大小分別為1 cm×1 cm×1 cm和2 cm×2 cm×1 cm的兩份組織,經(jīng)無菌生理鹽水沖洗后迅速保存于-80℃冰箱或液氮中備用。

1.3.2 胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的檢測 采用Realtime-PCR檢測胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的表達。mRNA的檢測盒采用QIAGEN試劑盒,實驗操作按使用說明書。實驗涉及的引物(見表1)均由生物生工合成。實時熒光定量PCR的條件為:預(yù)變性95℃1 min,變性95℃15 s,退火56℃20 s,延伸72℃30 s,共30個循環(huán),最后延伸72℃10 min。Realtime-PCR檢測結(jié)果均采用相對定量分析方法2-△△Ct法。

1.3.3 胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的檢測 采用蛋白免疫印記(Western blotting)檢測胎膜中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的表達。組織蛋白提取采用QIAGEN試劑盒,抗體由Invitrogen公司提供。實驗方法均按照說明書操作,首先從胎膜組織中抽提蛋白質(zhì)并定量;其次經(jīng)變形聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳,首先將準備好的樣品液上樣,Marker加進第一個孔后最后一個孔中,然后100 V恒壓電泳分離蛋白;再次將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層,20 mA恒流條件下,4℃轉(zhuǎn)移過夜;然后Western blot膜的封閉和抗體孵育,化學(xué)發(fā)光法檢測,膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,經(jīng)X膠片曝光顯影;最用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對膠片進行掃描或拍照后的目標帶的分子量和凈光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的表達 采用相對定量分析方法2-△△Ct法得出結(jié)果,相比于正常組AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的相對表達量分別為0.738±0.125、0.784±0.207和0.691±0.115,表達量均下調(diào),且羊水量過少組與正常組比較,其AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的相對表達量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。反之,羊水量過多組AQP1、AQP8 mRNA的相對表達量分別為2.605、3.017,且與正常組比較,相對表達量均高于正常組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);但羊水量過多組AQP5 mRNA的相對表達量為0.682,相比于正常組其相對表達量下調(diào),并且兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8 mRNA的相對表達

2.2 胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的表達 以GAPDH蛋白表達量為內(nèi)參進行相對定量分析,羊水量過多組AQP1、AQP5、AQP8蛋白的相對表達量分別為1.638、2.506和1.917,與正常組(4.252、3.992、4.105)比較,表達量均下調(diào),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。反之,羊水量過少組AQP1、AQP8蛋白的相對表達量分別為8.348、7.341,且與正常組比較,相對表達量均高于正常組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);但羊水量過少組AQP5蛋白的相對表達量為1.904,相比于正常組其相對表達量下調(diào),并且兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 胎膜組織中AQP1、AQP5、AQP8蛋白的相對表達

3 討 論

迄今為止,臨床上仍有很多不明原因的羊水量異?;颊撸瑢ρ蛩慨惓5牟±頇C制臨床基礎(chǔ)研究顯示仍未十分清楚,目前也沒有很好的預(yù)防與治療措施。近年來隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展,羊水量異常引起了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)者的高度重視。眾所周知,正常生理代謝情況下,羊水的產(chǎn)生與吸收是動態(tài)平衡的過程,當(dāng)產(chǎn)生與吸收兩者任何一個過程發(fā)生異常時,都會導(dǎo)致羊水量異常。水通道蛋白是一類膜蛋白,廣泛存在與動植物及微生物的膜表面,介導(dǎo)水的跨膜轉(zhuǎn)運并參與調(diào)節(jié)細胞的滲透平衡,其蛋白發(fā)生機能障礙與體內(nèi)水平衡紊亂性疾病有著密切關(guān)系[7]。迄今為止,國內(nèi)外學(xué)者至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13中AQP,其中有7種AQP蛋白在人胎膜、胎盤組織中有表達。有學(xué)者認為,AQPs參與了母胎之間的液體交換,與羊水量的調(diào)節(jié)有著密不可分的關(guān)系[4]。

AQP1是首個發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白,有學(xué)者指出該蛋白分布在羊膜上皮細胞、胎盤血管內(nèi)皮細胞等,是羊水膜內(nèi)吸收的重要調(diào)控因素[8]。AQP5目前研究較少,但有研究指出,胚胎肺發(fā)育正常中AQP5的基因表達量明顯降低,且該蛋白與肺臟的液體代謝關(guān)系密切[9]。AQP8蛋白屬于水通道蛋白家族中經(jīng)典的蛋白亞群,對水有著專一的通透性,并有研究指出AQP8在妊娠產(chǎn)婦的羊膜、胎盤等組織中均有表達[10]。因此,本研究通過檢測AQP1、AQP5、AQP8在羊水量異常的足月孕婦胎膜中的表達,探討AQP1、AQP5、AQP8與羊水量調(diào)節(jié)的相關(guān)性。通過我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于正常組,羊水過少組中AQP1的mRNA表達為下調(diào),但AQP1的蛋白表達卻為上調(diào),反之在羊水過多組中AQP1的mRNA為上調(diào),蛋白的表達卻為下調(diào)。Mann等[11]提出羊水過多的機制可能是胎膜中AQP1蛋白表達減少而引起的羊水膜內(nèi)吸收減少從而導(dǎo)致羊水過多。但另有研究卻指出AQP1的mRNA表達上調(diào)不是引起羊水過多的影響因素,而是羊水過多的一種代償性反應(yīng)[12]。結(jié)合我們的研究結(jié)果說明,導(dǎo)致羊水過多的原因是AQP1蛋白的表達下調(diào)可能會減少羊水的吸收。本研究結(jié)果還顯示,羊水過多組與過少組中AQP5的mRNA表達均下調(diào),且蛋白表達均下調(diào)。有研究指出胚胎肺發(fā)育正常中AQP5的基因表達量明顯降低,且該蛋白與肺臟的液體代謝關(guān)系密切[9]。由此說明羊水代謝的異常可能是因為AQP5蛋白的表達下調(diào)引起,進一步導(dǎo)致羊水量異常。再者本研究還發(fā)現(xiàn),相比于正常組羊水過少組AQP8的mRNA表達均為下調(diào),蛋白表達卻為上調(diào),但羊水過多組中AQP8的mRNA為上調(diào),蛋白的表達卻為下調(diào)。有研究認為AQP8在羊水過多產(chǎn)婦中mRNA和蛋白表發(fā)均高于正常組[13],這與本結(jié)果有一定的差異性,其原因可能是樣本差異性或檢測差異所造成的。從我們的結(jié)果可以得出,AQP8蛋白下調(diào)可能會造成羊水過多。

綜上所述,羊水量異常是導(dǎo)致妊娠不良結(jié)局的重要因素之一,嚴重危害產(chǎn)婦與胎兒的生命健康。為了有效控制羊水量異常的發(fā)生,必須找到其發(fā)病機理。AQPs蛋白介導(dǎo)水的跨膜轉(zhuǎn)運并參與調(diào)節(jié)細胞的滲透平衡,其蛋白發(fā)生機能障礙與體內(nèi)水平衡紊亂性疾病有著密切關(guān)系。本研究初步證實AQP1和AQP8蛋白的低表達可能會造成羊水吸收減少而導(dǎo)致羊水過多,而導(dǎo)致羊水量異常的另一原因可能是因為AQP5蛋白的表達下調(diào)而引起羊水代謝的異常造成的。

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Expression and significance of AQP1,AQP5,AQP8 and mRNA in patients with abnormal amniotic fluid volume.

ZHANG Ya,SHI Zi-yun,BAI Run-fang.Department of Obstetrics,the People's Hospital of Shaanxi,Xi'an 710068,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between AQP1,AQP5,AQP8 and amniotic fluid volume regulation,in order to further elucidate the molecular mechanism of abnormal amniotic fluid volume.MethodsA total of 120 cases of lying-in woman underwent cesarean section,who admitted to our hospital from January 2012 to December 2015,were selected as the research objects and divided into the oligohydramnios group,polyhydramnios group and normal group,with 40 cases in each group.AQP1,AQP5,AQP8 mRNA and protein expression levels were detected by Western blotting and Q-PCR,and the correlation with abnormal amniotic fluid volume was analyzed.ResultsCompared with the normal group,AQP1 mRNA level in the oligohydramnios group was down-regulated,and AQP1 protein expression was up-regulated,whereas AQP1 mRNA was up-regulated and protein expression was down-regulated in the polyhydramnios group.The differences between the groups were statistically significant(P<0.05).AQP5 mRNA level and protein expression were down-regulated in the oligohydramnios group,polyhydramnios group,and the difference between the groups was statistically significant(P<0.05).In the oligohydramnios group,AQP8 mRNA was down-regulated and AQP8 protein expression was up-regulated,whereas in the oligohydramnios group,AQP8 mRNA was up-regulated and AQP8 protein expression was down-regulated.The differences between the groups were statistically significant(P<0.05).ConclusionThe low protein expression of AQP1 and AQP8 may result in a reduction of amniotic fluid absorption,resulting in polyhydramnios.The down-regulated protein expression of AQP5 may cause the abnormal amniotic fluid metabolism,resulting in too much or too little amniotic fluid volume.

Aquaporin;mRNA;Amniotic fluid volume;Abnormality;Correlation

R714.46+8

A

1003—6350(2016)19—3115—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.19.006

2016-04-06)

陜西省科學(xué)技術(shù)基金項目(編號:2015SF131)

石紫云。E-mail:shiziyun1974@163.com

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