王志杰　劉偉　崔燕　王翔飛

【摘要】目的：利用響應(yīng)面法優(yōu)化沙棗葉黃酮的提取工藝。方法：在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取時間、提取溫度及提取pH值為考查因素，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝：料液比1∶16、提取時間8h、提取溫度60℃、提取pH值為8。結(jié)論：采用該提取工藝所得總黃酮提取率為6.49%，與響應(yīng)曲面擬合所得方程預(yù)測值6.52%符合良好。

【關(guān)鍵詞】沙棗葉；黃酮；工藝優(yōu)化；響應(yīng)面法

【中圖分類號】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0009-03

沙棗（Elaeagnu sangustifolia L.）又名香柳、桂香柳、銀柳、七里香等，屬胡禿子科落葉小喬木或灌木，我國主要分布于西北各省[1]。新疆沙棗資源蘊(yùn)藏量大，生長快，易繁殖，藥用價值高，且各地均有分布[2]。沙棗葉干燥后搓碎加水服用，對肺炎有很好的療效；沙棗葉含有的苷類、生物堿、咖啡酸、綠原酸、黃酮類等物質(zhì)，具有抗心律失常[3]、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等作用[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，沙棗葉水提取物可降低小鼠肝組織自發(fā)性MDA的生成，減輕CCl4、H2O2、Fe2+-VitC誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有良好的抗脂質(zhì)過氧化作用[5]。

黃酮是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物。沙棗作為一種自由基清除劑，是理想的天然抗氧化劑之一，李紅等[5]報道了沙棗黃酮提取液對多種自由基均具有較強(qiáng)的清除能力。本文以沙棗葉中總黃酮為研究對象，以水作為提取溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化沙棗葉黃酮提取工藝條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器 722N 可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；恒溫水浴鍋。

1.2 材料 蘆丁對照品（批號：100080-200707，中國藥品生物制品檢定所）；沙棗（采自新疆石河子市）由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院譚勇教授鑒定為Elaeagnu sangustifolia L.；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的分光光度法測定沙棗中黃酮類化合物[5-9]。精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg，置于10mL容量瓶，加70%乙醇適量，使充分溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，所得溶液含蘆丁對照品1mg/ml。準(zhǔn)確吸取1.0mg/ml蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml，分別置于25ml的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液0.3ml，搖勻，放置6min，再加入10% Al（NO3）3溶液0.3ml，搖勻，放置6min，加入4%NaOH溶液4.0ml，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，在510nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品溶液的濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，分析得出線性回歸方程為Y=0.0948x-0.0523，r=0.9991，線性關(guān)系良好。

2.2 總黃酮含量的測定 吸取待測提取液5ml置于25ml容量瓶，參照上述方法測吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）與吸光度（A）的回歸方程，計算蘆丁的含量。總黃酮的提取率公式：總黃酮提取率（%）=（提取液濃度×體積×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量）×100%。

2.3 提取工藝優(yōu)化試驗 設(shè)置不同的液料比、提取時間、提取溫度、pH值，觀察不同單因素對提取率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以A（料液比）、B（提取時間）、C（提取溫度）和D（pH值）為自變量，以總黃酮得率（%）為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。試驗數(shù)據(jù)使用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行分析，并得到響應(yīng)面分析圖和方差分析表。試驗因素及水平見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取條件對總黃酮提取效果的影響

3.1.1 液料比對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉末4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水，提取時間為4h、溫度為室溫、提取2次的條件下，分別加10、15、20、25倍水量提取總黃酮，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法考察液料比對沙棗葉黃酮提取效果的影響。沙棗葉黃酮的得率分別為0.12%、0.39%、0.38%、0.36%，因選料液比為1∶15。

3.1.2 提取時間對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水、料液比為1∶15、溫度為室溫、提取2次、提取時間為4、6、8、10h的條件下，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法考察提取時間對沙棗葉黃酮提取效果的影響。比較總黃酮得率分別為2.34%、3.69%、4.01%、3.98%，當(dāng)提取時間為8h時，提取效果最佳。

3.1.3 提取溫度對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水、料液比為1∶15、提取時間為6h、提取1次的條件下，設(shè)置提取溫度為20、40、60、80℃，分別按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法考察提取溫度對沙棗葉黃酮提取效果的影響。經(jīng)計算各溫度下的提取率分別是3.36%、3.40%、3.82%、3.59%，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時提取效果最佳。

3.1.4 pH對提取效果的影響 分別稱取1g干燥的沙棗葉粉4份，分別置于100ml三角燒瓶中，在提取溶液為蒸餾水、料液比為1∶15，提取時間為6h、提取溫度為60℃，提取1次的條件下，設(shè)置pH值為6、8、10，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法考察pH對沙棗葉黃酮提取效果的影響。提取率分別為0.27%、0.32%、0.38%、0.37%，從結(jié)果可以看出，隨著pH值的增加，對提取效果的影響逐漸增大，當(dāng)pH超過8，提取效果最優(yōu)。

3.2 沙棗葉黃酮提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化分析 響應(yīng)面試驗共有29個試驗點(diǎn)，設(shè)計及結(jié)果如表2。采用響應(yīng)面分析法分析試驗結(jié)果，得到以總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程為：黃酮得率=6.47+0.45A+0.11B+0.044C+0.063D-0.088AB-0.25AC+0.035AD-0.045BC+0.022BD-0.048CD-1.17A2-0.45B2-0.41C2-0.49D2（r=0.9758）。由表3可知，以黃酮得率為響應(yīng)值時，模型P<0.0001，表明該二次方程模型高度顯著，可用于指導(dǎo)沙棗葉總黃酮提取試驗設(shè)計。各因素對黃酮提取量的影響由大到小依次為料液比>提取時間>Ph值>提取溫度，總黃酮提取率的變化有97.58%來源于所選變量的變化。由表3可知，一次項A，交互項AC，二次項A2、B2、C2、D2均具有極顯著差異（P<0.01）；失擬項P>0.05，說明擬合度良好，未知因素對于實驗結(jié)果的干擾很小。

響應(yīng)面分析法的圖形是特定的響應(yīng)值對應(yīng)的各因素構(gòu)成的一個三維空間，直觀地反映出各因素對響應(yīng)值的影響，從試驗所得的響應(yīng)面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用[10]，各因素間交互作用的響應(yīng)面圖，見圖2。

由圖2可看出，在料液比較小的情況下，提取時間、提取溫度、pH值的增加，曲面向下彎曲，說明料液比與三者的交互作用抑制了總黃酮的浸出，由等高線可以分析出，料液比在較小的情況下等高線排列緊密，后三者與對于總黃酮的浸出影響較大，隨著這三者的增加，得率呈現(xiàn)上升趨勢，但到達(dá)一定程度后又開始下降。同理可分析其他因素見得相互作用。

3.3 驗證試驗 經(jīng)過Design-Expert 8.0軟件的分析，可以得出沙棗葉總黃酮提取的最佳條件為料液比為1∶15.96，提取時間為8.20h，提取溫度為59.73℃，pH值為8.15，總黃酮的得率為6.51%。考慮可操作性，將工藝參數(shù)修正最佳條件料液比為1∶16，提取時間為8.00h，提取溫度為60℃，pH值為8，按造修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果總黃酮的得率為6.49%，與預(yù)測值之間的相對偏差為0.46%，因而說明該工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇固液比、提取時間、提取溫度及提取pH值為考查因素，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化提取工藝條件，以總黃酮得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法優(yōu)化沙棗葉黃酮提取工藝。結(jié)果表明，采用Box-Behnken法建立沙棗葉總黃酮提取工藝模型得率高，并能很好地預(yù)測試驗結(jié)果。

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（收稿日期：2015.09.22）