呂振斌, 曾小東, 田孝東, 趙昌明, 虞 沂, 段建利, 鄧子新

(武漢大學(xué)藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430071)

米貝鏈霉菌DSM41911的米爾貝霉素生物合成的初步研究

呂振斌, 曾小東, 田孝東, 趙昌明, 虞 沂, 段建利*, 鄧子新

(武漢大學(xué)藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430071)

對米貝鏈霉菌DSM41911進行初步研究，通過對16S rRNA及相關(guān)功能基因序列進行生物信息學(xué)分析，表明米貝鏈霉菌DSM41911與冰城鏈霉菌具有較高同源性。設(shè)計16種固體和液體培養(yǎng)基對菌株的發(fā)酵條件進行篩選，在MB4、MB6培養(yǎng)基中成功檢測到milbemycin B5、milbemycin E、milbemycin VM44864和milbemycin B1。參考近似菌株冰城鏈霉菌的合成基因并結(jié)合文獻推測出米爾貝霉素在米貝鏈霉菌DSM41911中的合成途徑，為后續(xù)高產(chǎn)菌株的篩選提供參考。

米爾貝霉素；發(fā)酵；生物合成；16S rRNA

1967年，日本Sankyo公司的青木(Aoki)等人從鏈霉菌Streptomyceshygroscopicussubsp.aureolacrimosus的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)米爾貝霉素(milbemycin)[1]。米爾貝霉素屬于十六元大環(huán)內(nèi)脂化合物，目前已報導(dǎo)60多種組分[2-4]。米爾貝霉素作為γ-氨基丁酸(GABA)激動劑，引發(fā)突觸前體釋放GABA[5]，通過引起谷氨酸門控Cl-通道的開放，使Cl-內(nèi)流量增加，從而使神經(jīng)元休止電位超級化，不能釋放正常的動作電位，最終導(dǎo)致昆蟲死亡[6-7]。由于哺乳動物體內(nèi)GABA僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而米爾貝霉素不能通過哺乳動物的血腦屏障，所以米爾貝霉素類抗蟲藥對哺乳動物具有很高的安全性[8]。米爾貝霉素作為一種廣譜、高效、安全、易降解的生物殺蟲劑，對各種螨蟲、農(nóng)業(yè)害蟲及家畜寄生蟲均有很好的治療效果，被廣泛應(yīng)用于抗寄生蟲藥和作物保護農(nóng)藥，具有廣闊的市場前景和巨大的經(jīng)濟價值[9-10]。國外公司如日本三共株式會社、美國默克公司和瑞士諾華制藥廠均生產(chǎn)米爾貝霉素及相關(guān)制劑，但由于菌株保護，知識產(chǎn)權(quán)等問題，國內(nèi)市場基本被跨國公司壟斷，國內(nèi)相關(guān)研究仍處在起步階段。向文勝等[11-12]從冰城鏈霉菌(Streptomycesbingchenggensis)發(fā)酵產(chǎn)物中成功分離出多種米爾貝霉素組分，并公布了冰城鏈霉菌全基因組序列，但米爾貝霉素產(chǎn)量仍有待提高。要想實現(xiàn)米爾貝霉素生產(chǎn)的工業(yè)化，就必須對米爾貝霉素的生物合成途徑進行研究，進而篩選出米爾貝霉素的高產(chǎn)菌株。本研究將對米貝鏈霉菌DSM41911進行初步發(fā)酵研究，并對米爾貝霉素生物合成途徑進行初步探索，為后續(xù)高產(chǎn)菌株的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 米貝鏈霉菌DSM41911，來自德國DSMZ保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①產(chǎn)孢培養(yǎng)基：黃豆餅粉20，甘露醇20，瓊脂20；②TSBY：Oxoid胰蛋白胨大豆肉湯30，蔗糖103，酵母提取物 5；③種子液培養(yǎng)基：蔗糖5，聚蛋白胨1.75，K2HPO40.25，pH 7.2；④液體發(fā)酵培養(yǎng)基：MB1：蔗糖120，棉子粉11，黃豆餅粉11，脫脂奶粉11，K2HPO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CaCO32.5，pH 7.2；MB2：玉米粉100，黃豆餅粉10，棉子粉10，α-淀粉酶0.2，NaCl 1，K2HPO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 1，CaCO37，pH 7.0；MB3：蔗糖80，黃豆餅粉10，酵母提取物2，肉提取物1，CaCO33，K2HPO40.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，pH 7.2；MB4：可溶性淀粉70，酵母提取物16，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 4，CoCl2·6H2O 0.01，CaCO32，pH 7.2；MB5：蔗糖160，黃豆餅粉20，酵母提取物5，肉提取物5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，CaCO33，pH 7.2；MB6：蔗糖70，黃豆餅粉14，酵母提取物2.5，NaCl 0.1，CaCO31，K2HPO40.5，MOPS(丙磺酸) 10，pH 7.2；MB7：玉米粉65 ,黃豆餅粉10，酵母粉1，K2HPO40.5，α-淀粉酶0.5，pH 7.2；MB8：葡萄糖60，酵母提取物2，NaCl 2，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO4·4H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.05，CaCO35，pH 7.2；⑤固體發(fā)酵培養(yǎng)基：NO.1:麥芽糖20，葡萄糖10，酵母粉4，棉子粉7.5，青島瓊脂20， pH 7.0；NO.2:蔗糖40，燕麥粉7.5，番茄醬5，CaCO33，青島瓊脂20，pH 7.0；NO.3:蔗糖20，黃豆餅粉10，玉米漿10，KCl 8，青島瓊脂20， pH 6.5；NO.4:葡萄糖4，麥芽抽提物10，CaCO32，青島瓊脂20，pH 7.0；NO.5:蔗糖20，黃豆餅粉10，玉米漿10，KCl 8，青島瓊脂20，pH 6.5；NO.6:酵母提取物4，麥芽提取物10，葡萄糖4，青島瓊脂20，pH 8.0；NO.7:葡萄糖10，黃豆餅粉10，米漿10，甘油5，酵母粉5，NaCl 5，CaCO32，青島瓊脂20，pH 7.0；NO.8:可溶性淀粉20，子粉5，酵母抽提物2.5，NaCl 1，K2HPO40.75，MgSO4·7H2O 1，CaCO33，青島瓊脂20，pH 7.5。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；Genenap凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)；臺式冷凍離心機Sorvall Legend MICRO 17(美國Thermo公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-2102C(武漢大風(fēng)生物科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀BUCHI Rotavator R-200 (瑞士BUCHI公司)；液質(zhì)聯(lián)用儀Thermo Scientific LTQ Orbitrap (美國Thermo 公司)；高壓滅菌器HVE-50(日本HIRAYAMA公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)已公布的冰城鏈霉菌全基因組，分別設(shè)計擴增16S rDNA、I型PKS 加載域以及C-5氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因的引物(表1)。

1.2.2 米貝鏈霉菌DSM41911的初步鑒定 采用Chelex 100法提取鏈霉菌DSM41911的基因組DNA，采用1.2.1中設(shè)計的引物分別對16S rRNA、I型PKS加載域以及C-5氧甲基轉(zhuǎn)移酶的基因進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)至DH10B感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒后由南京金斯瑞公司測序，測序結(jié)果在NCBI進行BLAST 比對。

表1 基于冰城鏈霉菌全基因組設(shè)計的引物

1.2.3 米貝鏈霉菌DSM41911的發(fā)酵培養(yǎng) 液體發(fā)酵根據(jù)培養(yǎng)基的不同進行的發(fā)酵天數(shù)不同，首先接種100 μL的孢子液于裝有50 mL的種子液培養(yǎng)基中，待菌體生長一定時間后以1∶10的比例轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)。對于種子液培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基進行7 d培養(yǎng)，MB1、MB2、MB3、MB5、MB7培養(yǎng)基進行5、6、7、8 d培養(yǎng)，MB4、MB6、MB8培養(yǎng)基進行5、6、7 d培養(yǎng)。對于固體發(fā)酵，所有培養(yǎng)基均進行5、7、10 d發(fā)酵。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的處理 對液體培養(yǎng)基：離心使上清和菌絲體分開，分別收集上清和菌絲體，上清冷凍干燥，用色譜級甲醇溶解制樣；菌絲體用V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1振蕩，超聲30 min進行細胞破碎，過濾，濾液旋干，用甲醇溶解制樣。對固體培養(yǎng)基：將培養(yǎng)基切碎，甲醇浸泡5 h，過濾，濾液旋干后用甲醇溶解制樣。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)C-MS檢測 HPLC分離條件：Dikma 公司的Diamonsil C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，洗脫條件：A為0.1%的乙酸水溶液，B為乙腈。0～3 min：5%B～20%B，3～15 min：20%B～60%B，15～20 min：60%B～80%B，20～35 min：80%B～20%B；流動相的流速為800 μL/min，樣品進樣量為10 μL。發(fā)酵產(chǎn)物MS-ESI檢測參數(shù)：離子源：電噴霧ESI；霧化氣壓力：0.8×105Pa；毛細管電壓：4.5 kV；干燥氣：N2；干燥氣流速：8 L/min；干燥氣溫度：275 ℃；掃描分子量范圍：200～1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 米貝鏈霉菌DSM41911基因水平的驗證

在NCBI上的比對結(jié)果顯示米貝鏈霉菌DSM41911的16S rRNA基因序列與冰城鏈霉菌的相似性為99%，同源性較高(見表2)；且功能基因I型PKS加載域序列與冰城鏈霉菌完全一致，MilD同源性高達99%(見表3)，表明米貝鏈霉菌DSM41911具有生產(chǎn)米爾貝霉素的潛力。而對于合成途徑中其他功能基因由于在冰城鏈霉菌全基因組的報道中并沒有明確的指出，所以暫時也無法設(shè)計引物對其他基因進行特異性擴增。

表2 16S rRNA同源比對結(jié)果

表3 MilD和加載域的同源比對結(jié)果

2.2 米貝鏈霉菌DSM41911發(fā)酵結(jié)果分析

對米貝鏈霉菌DSM41911進行了大量固體和液體發(fā)酵驗證，在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中均未檢測出米爾貝霉素產(chǎn)物；對液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)物進行LC-MS數(shù)據(jù)分析，對于培養(yǎng)5、6、7 d的液體發(fā)酵培養(yǎng)基MB4、MB6、MB8，在發(fā)酵7 d的MB4菌絲體中檢測到milbemycin B5[M+Na]+(如圖1，Δppm值為-6.0)，在發(fā)酵5 d的MB6菌絲體中檢測milbemycin E[M+Na]+(如圖2，Δppm值為-7.7)、milbemycinVM44864[M+H]+(如圖3，Δppm值為-3.6)和milbemycin B1 [M+H]+(如圖4，Δppm值為-3.2)。但是在培養(yǎng)6、7、8 d的液體發(fā)酵培養(yǎng)基MB1、MB2、MB3、MB5、MB7中均未檢測到米爾貝霉素產(chǎn)物，對此批培養(yǎng)基進行5 d的液體發(fā)酵對比，仍未檢測出米爾貝霉素產(chǎn)物。未檢測到milbemycin組分的培養(yǎng)基，可能是米爾貝霉素產(chǎn)量過低，也可能是受培養(yǎng)基成分影響未產(chǎn)生米爾貝霉素。

圖1 MB4發(fā)酵7 d LC-MS檢測結(jié)果Fig.1 LC-MS testing result of MB4 fermentation for seven days

2.3 米貝鏈霉菌生物合成基因簇和生物合成途徑的推測

米爾貝霉素屬于I型PKS的阿維菌素的結(jié)構(gòu)類似物，其生物合成基因簇中包含一條特異性強的PKS途徑。根據(jù)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向文勝教授課題組公布的冰城鏈霉菌的生物合成基因簇(如圖5)和米爾貝霉素類似物阿維菌素(Avermectin)和伊維菌素(Ivermectin)的合成途徑[13-14]，我們以milbemycin D為對象，對其生物合成途徑做出如下推測：米爾貝霉素通過Ⅰ型聚酮合酶(PKS typeⅠ)途徑合成，該聚酮合酶由1個起始模塊和12個延伸模塊組成，分別由milA1、milA2、milA3和milA4四個基因編碼。其生物合成過程：首先起始模塊加載1分子異丁酸形成異丁酰-ACP，在延伸過程中先后加載7分子乙酸和5分子丙酸，經(jīng)最后一個延伸單元上的硫酯酶(TE)催化，脂肪長鏈從ACP上解離并由milC催化閉合成環(huán)，再經(jīng)過MilF(酮基還原酶)、MilE(細胞色素P450羥化酶)、MilD(C-5氧甲基轉(zhuǎn)移酶)催化最終形成milbemycin D(如圖6)。

圖2 MB6發(fā)酵5 d LC-MS檢測結(jié)果(I)Fig.2 LC-MS testing result of MB6 fermentation for five days(I)

圖3 MB6發(fā)酵5 d LC-MS檢測結(jié)果(II)Fig.3 LC-MS testing result of MB6 fermentation for five days(II)

圖4 MB6發(fā)酵5 d LC-MS檢測結(jié)果(III)Fig.4 LC-MS testing result of MB6 fermentation for five days(III)

圖5 米爾貝霉素生物合成基因簇的推測Fig.5 The conjecture on Biosynthetic gene cluster of milbemycin

圖6 米爾貝霉素生物合成途徑的推測Fig.6 The conjecture on biosynthetic pathway of milbemycin

3 討 論

目前米爾貝霉素類藥品已經(jīng)在世界范圍內(nèi)實現(xiàn)了商業(yè)化，米爾貝霉素發(fā)酵也成為國內(nèi)研究的熱點領(lǐng)域。本研究通過對特異性較高的16S rRNA、I型PKS加載域和MilD基因測序并進行生物信息學(xué)比對，發(fā)現(xiàn)米貝鏈霉菌DSM41911與冰城鏈霉菌同源性較高。同時對其進行一系列固、液發(fā)酵，得到milbemycin B5、milbemycin B1、milbemycin VM4486 和 milbemycin E等4種米爾貝霉素，初步確認菌株的發(fā)酵條件。結(jié)合冰城鏈霉菌的合成基因簇和米爾貝霉素類似物阿維菌素(Avermectin)和伊維菌素(Ivermectin)的合成途徑推測出米爾貝霉素的生物合成途徑，為后續(xù)高產(chǎn)菌株的篩選提供理論依據(jù)，為米爾貝霉素在國內(nèi)的工業(yè)生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

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Preliminary Study on Milbemycin Biosynthesis ofStreptomycesmilbemycinicusDSM41911

LYU Zhen-bin, ZENG Xiao-dong, TIAN Xiao-dong, ZHAO Chang-ming, YU Yi, DUAN Jian-li, DENG Zi-xin

(KeyLab.ofCombinat’lBiosynth.andDrugDiscov.,Minist.ofEducat’n,Schl.ofPharm.Sci.,WuhanUni.,Wuhan430071)

StreptomycesmilbemycinicusDSM41911 was carried out initial study, through bioinformatics analysis of 16S rDNA sequence and sequence of other functional genes indicated that there were a high homology possessed betweenS.milbemycinicusDSM41911 andS.bingchenggensis. 16 different kinds of solid and liquid media were designed for screening suitable for fermentation condition of the strain, milbemycin B5, milbemycin B1, milbemycin VM4486 and milbemycin E were successfully detected in MB4 and MB6 medium. A possible biosynthesis pathway of milbemycin inS.milbemycinicusDSM41911 was speculated referring to synthetic gene ofS.bingchenggensiscombined with literatures, providing theoretic foundations for the screening of milbemycin high-production strains.

milbemycin; fermentation; biosynthesis; 16S rRNA

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20110141120017)；武漢市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2013020501010176)

呂振斌 男，碩士研究生。研究方向為生物制藥。E-mail:zhenbinlv@163.com

* 通訊作者。男，博士，講師。研究方向為生物制藥。E-mail:kitty_fen@126.com

2016-01-25；

2016-03-11

Q936

A

1005-7021(2016)06-0024-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.004