任遠(yuǎn) 司維 任恒 李沖 李璐璐 王霆(河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部 河南鄭州 450003)

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ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及應(yīng)對(duì)抗生素耐藥性的概述

任遠(yuǎn) 司維 任恒 李沖 李璐璐 王霆
(河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部 河南鄭州 450003)

【關(guān)鍵詞】細(xì)菌;耐藥泵;治療手段

細(xì)菌已經(jīng)衍生出許多巧妙的策略來抵抗微生物的治療:靶點(diǎn)修飾,藥物失活,酶降解,或者是降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度(亦或是降低穩(wěn)定性?促進(jìn)藥物的外流)?在這諸多策略之中,外流策略是最為普遍也最為基礎(chǔ)的機(jī)制,然而目前而言,這種機(jī)制似乎最為重要是因?yàn)樗哂惺谟杓?xì)菌多重耐藥性(MDR)表現(xiàn)型的能力,從而導(dǎo)致一些細(xì)菌株能夠?qū)δ壳八幸阎闹委煯a(chǎn)生耐藥性[1]?在外泵機(jī)制中所起作用最顯著和廣泛的當(dāng)屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(ATP-binding cassete transporter proteins,ABC Protein)?本文將就原核生物中ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu),它們與抗生素耐受性以及與抗細(xì)菌治療策略的關(guān)系展開論述?

1 簡(jiǎn)介

外流泵參與了細(xì)菌內(nèi)許多生理功能:它們主要被視為“細(xì)胞清潔者",但它們同樣在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮重要作用[2]?在抗生素治療的壓力下,它們會(huì)發(fā)生高表達(dá)從而提高抗生素的最小抑菌濃度(MIC),使耐藥性機(jī)制進(jìn)一步加強(qiáng),最終導(dǎo)致抗菌治療的失敗?由于一些轉(zhuǎn)運(yùn)分子是由可移動(dòng)的基因片段所編碼,導(dǎo)致這種耐藥性機(jī)制會(huì)在種內(nèi)和種間迅速傳播,從而進(jìn)一步增加尋找合適治療方案的難度,并對(duì)環(huán)境中細(xì)菌耐藥性的免疫因子施加了選擇性的壓力[3]?

細(xì)菌外流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要是由Ⅱ-型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(取決于質(zhì)子動(dòng)力或是鈉離子動(dòng)力)組成?Ⅱ-型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要屬于以下幾個(gè)蛋白家族:多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MATE),主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(MDF),抗結(jié)核分離蛋白(RND)以及小多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SMR)家族?然而,ABC家族的MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌中均已見報(bào)道[4],并且對(duì)于原核菌種的大量基因分析工作使許多假想的ABC家族的外流泵得到了證實(shí)[5]?最近,一個(gè)細(xì)菌ABC蛋白(與多重耐藥性相關(guān))的晶體結(jié)構(gòu)已被測(cè)定,使能量耦合與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制得以被窺探[6-7]?許多ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都與抗生素耐受性有關(guān);在它們當(dāng)中,有一些授予了細(xì)菌以多重耐藥性的表現(xiàn)型,使細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)于多種?混合的抗生素的耐藥性?最近,在對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的抗生素保護(hù)中,一種植物來源的ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被作為耐受性的決定因素加以使用;結(jié)果表明,當(dāng)該種ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過度表達(dá)時(shí),植物對(duì)于卡那霉素產(chǎn)生了顯著的耐受性,說明這些外流系統(tǒng)或許可以有效地保護(hù)活體細(xì)胞免于抗生素的作用[8]?

2 細(xì)菌中的ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白確與抗生素耐受性有關(guān)

首見報(bào)道的與抗生素耐受性有關(guān)的細(xì)菌ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是MsrA,一種從葡萄球菌中分離得到?由質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)菌對(duì)14/15碳大環(huán)內(nèi)酯類抗生素?B-型鏈陽(yáng)霉素的耐受性有關(guān)[9]?90年代初細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的機(jī)制就已在二級(jí)反向運(yùn)輸系統(tǒng)中見報(bào)道[10],首次發(fā)現(xiàn)與多重耐藥性有關(guān)的細(xì)菌ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是1996年在乳球菌中得到的LmrA[11]?似乎這些二級(jí)蛋白與抗生素耐受性?抗菌治療的失敗有所關(guān)聯(lián)(特別是革蘭氏陰性菌種來自MFS和RND蛋白家族的二級(jí)蛋白)?這些多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的許多都被研究過,例如金黃色葡萄球菌中的NorA,或者是綠膿桿菌中的MexAB-OprM系統(tǒng)?并且,現(xiàn)已發(fā)展了許多規(guī)避上述蛋白的治療策略?

然而近些年,對(duì)于細(xì)菌ABC家族外流系統(tǒng)對(duì)抗生素耐受性的貢獻(xiàn)卻少有報(bào)道?并且這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在抗生素生產(chǎn)器官中的作用主要被認(rèn)為是分泌藥物并對(duì)生成的抗生素產(chǎn)生自衛(wèi)性?耐受性[12]?如今,隨著許多菌種的基因測(cè)序工作已經(jīng)全部完成,分子生物學(xué)技術(shù)(基因敲除與過度表達(dá)研究)也得到長(zhǎng)足進(jìn)步,大量假象的ABC家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)?它們當(dāng)中越來越多被證實(shí)與許多菌株的抗生素耐受性有關(guān)?所有這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都表現(xiàn)出顯著水平的抗生素耐受性(對(duì)照組與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的組之間MIC值至少有4倍的差異)?幾乎每類抗生素都受到了影響,并且ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白催化的抗微生物藥物的主動(dòng)外流過程,在革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌種均有發(fā)生?在所有被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之中,很少被視為是多重耐藥性蛋白[13],而是更多地被稱為小MDR蛋白(SDR)?在考慮藥物治療策略時(shí),多重耐藥性泵更為重要,因?yàn)樗鼈兣c細(xì)菌對(duì)多種抗生素的適應(yīng)過程有貢獻(xiàn),從而導(dǎo)致產(chǎn)生越來越多的菌種特異性耐藥機(jī)制,最終可能產(chǎn)生十分耐受的菌株,對(duì)臨床研究和社會(huì)防治都產(chǎn)生巨大的威脅?

被研究最多的細(xì)菌ABC家族多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是乳酸菌中的LmrA?這個(gè)基因編碼的蛋白與人體的P-糖蛋白(P-gP)具有結(jié)構(gòu)上的同源性,然而其與P-gP不同的是,Lm rA是由兩個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成,并以同源二聚體的形式發(fā)揮功能[14]?這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物耐受的大腸桿菌株中表達(dá),并發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致對(duì)多種抗生素和其他藥物(這些藥物在結(jié)構(gòu)上和功能上都無(wú)聯(lián)系)的耐受性?其他的具有廣譜底物親和性的多重耐藥性ABC家族泵也在細(xì)菌中得以發(fā)現(xiàn),然而此處我們只關(guān)注那些與臨床使用抗生素耐受性相關(guān)的多重耐藥性ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?基于如此意圖,缺少一些主要多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的耐藥菌株將會(huì)是非常棒的工具,從而用于確定多重耐藥性外流泵的潛在底物范圍?其他主要的與抗生素耐受性有關(guān)的多重耐藥性ABC家族外流泵包括EfrAB?VcaM和MacAB?鑒于其命名和底物范圍,后面兩種更像SDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員?為了紀(jì)念這個(gè)發(fā)現(xiàn),這兩種耐受且不斷增長(zhǎng)的菌株被分別命名為SP2073和SP2075[15]?

細(xì)菌中多重藥物的外流機(jī)制正被廣泛討論,而且?guī)缀鯚o(wú)爭(zhēng)議地認(rèn)為多重藥物的外流泵是染色體編碼的,然而藥物特異性的外流機(jī)制似乎更可能是質(zhì)?；蛘咂渌梢苿?dòng)的基因片段(如轉(zhuǎn)位子,干擾素)編碼的?后一種機(jī)制促進(jìn)了菌種間的橫向轉(zhuǎn)移,并且使得耐受性決定因素如外流泵得以迅速分散傳播[16]?這一情況加重了多重耐受性(無(wú)論是致病菌還是非致病菌)菌種的發(fā)展情況,甚至可能導(dǎo)致公眾健康的隱患,成為一個(gè)環(huán)境問題?

3 ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在抗微生物治療策略中的應(yīng)用

在人類治療方面,ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于抗腫瘤藥物的研究是不可缺少的?關(guān)于抗菌治療,MDR和外排方面的興趣(關(guān)注)在近10 a得到提升,這個(gè)現(xiàn)象,現(xiàn)在被認(rèn)為是固有的和同樣伴隨過表達(dá),作為一種獲得性耐藥機(jī)制,很大程度上造成現(xiàn)在抗生素治療的弱點(diǎn)?特別是細(xì)菌次生轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白驅(qū)動(dòng)的外排,大部分研究已經(jīng)開展或正在進(jìn)行中[17]?細(xì)菌的ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白很少被關(guān)注因?yàn)樗鼈兩婕翱股赝馀诺拿枋鲚^少?盡管如此,最近在分子生物學(xué)和細(xì)菌基因工程方面的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展,提供了對(duì)于細(xì)菌外排過程的一個(gè)更好認(rèn)識(shí)?隨著越來越多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被鑒定,ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白似乎在多藥(包括抗生素)耐藥方面發(fā)揮著不可忽視的作用?同樣,其在環(huán)境適應(yīng)和細(xì)菌生存方面具有相應(yīng)的重要性,結(jié)合現(xiàn)在的三維結(jié)構(gòu)解析,使它們成為新抗菌策略的潛在靶點(diǎn)?

3.1 細(xì)菌的ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為免疫治療的靶點(diǎn) 眾所周知,ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能具有免疫原性,特別是位于表面的蛋白像外膜蛋白(OMPs)和(或)SBPs,提示它們可能被開發(fā)成針對(duì)治病菌株的疫苗的候選亞基?針對(duì)這些蛋白增加的重組抗體在感染小鼠模型的細(xì)菌中減少[18]?因此,有可能通過使用DNA疫苗使細(xì)菌過表達(dá)這些免疫原性的成分?這些疫苗的例子已經(jīng)被用來評(píng)價(jià)分枝結(jié)核桿菌感染,這些針對(duì)靜脈內(nèi)感染的有效保護(hù)通過使用PstS-3得到證實(shí),PstS-3是涉及磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)核分枝桿菌SBP中的一種[19]?

ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組分位于革蘭陰性菌的細(xì)胞膜內(nèi),同樣能夠刺激特定免疫反應(yīng),因?yàn)榘邢蚣?xì)胞質(zhì)蛋白的抗生素已經(jīng)用于恢復(fù)期血清(convalescent sera)[20]?進(jìn)一步研究需要確認(rèn)位于膜內(nèi)的蛋白刺激抗體反應(yīng)的過程?這個(gè)將提供更多的把ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為DNA疫苗的合理方法?

此外,當(dāng)用于和抗生素聯(lián)用時(shí)免疫治療可能得到加強(qiáng)?針對(duì)甲氧西林耐藥S.aureus(EMRSA-15)ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽提高的重組蛋白和萬(wàn)古霉素的聯(lián)用已經(jīng)結(jié)束3期臨床實(shí)驗(yàn),這個(gè)藥物聯(lián)用的所有反應(yīng)(細(xì)菌和臨床)比安慰劑和萬(wàn)古霉素聯(lián)用觀察到的結(jié)果好?

3.2 逆轉(zhuǎn)外排機(jī)制造成的細(xì)菌耐藥性 在治療細(xì)菌耐藥的過程中,面對(duì)MDR耐藥基因或者外排機(jī)制引起的耐藥性,除了發(fā)展新型的對(duì)外排泵不敏感的藥物,幾乎所有的策略都是選擇一種“外排泵抑制劑"與抗生素聯(lián)用來達(dá)到逆轉(zhuǎn)臨床上治療耐藥菌時(shí)產(chǎn)生的局限性[21]?這個(gè)思路極具合理性和前景,原因如下:①幾乎所有抗生素都產(chǎn)生了多藥耐藥現(xiàn)象(即使近來上市應(yīng)用到臨床的,如奎奴普丁-達(dá)福普汀,泰利霉素,替吉環(huán)素和利奈唑胺等);②應(yīng)用于合用策略的抗生素已經(jīng)證實(shí)他們?cè)谝吧途晟系挠行Щ钚?并且已經(jīng)有很豐富的毒性和生物利用度等相關(guān)數(shù)據(jù)資料的積累;③臨床上已經(jīng)證實(shí)一些耐藥抑制劑與抗生素的聯(lián)合應(yīng)用非常有效,比如克拉維酸鉀/阿莫西林就廣泛應(yīng)用于臨床治療上?為了在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)積聚更多的藥物,外泵抑制劑可以促進(jìn)藥物的攝入或者抑制外泵對(duì)藥物的排出,在過去20多年的基礎(chǔ)研究和工業(yè)制造上,這兩種方案被廣泛采用,并且繼續(xù)指導(dǎo)著抗菌藥物的未來研發(fā)和應(yīng)用?

3.2.1 增加抗生素的攝入 提高藥物的攝入有多種方法,其中之一就是將抗生素與細(xì)菌ABC家族攝入蛋白的天然底物連接起來?針對(duì)蛋白攝入系統(tǒng)設(shè)計(jì)的藥物早已有報(bào)道[22]?這個(gè)方法對(duì)原核生物有較高的特異性,因?yàn)樵O(shè)計(jì)時(shí)不得不遵循一個(gè)有趣的限制:設(shè)計(jì)的復(fù)合物的大小必須在攝入蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力范圍之內(nèi)[23]?盡管如此,這個(gè)創(chuàng)意提出了一個(gè)極具潛力的解決辦法?因?yàn)锳BC攝入蛋白對(duì)原核細(xì)胞具有特異性,并且這些蛋白的三維結(jié)構(gòu)最近已經(jīng)被確定,基于這些有利條件,針對(duì)ABC攝入系統(tǒng)開發(fā)的抗菌藥物將在未來具有廣闊前景?

3.2.2 降低抗生素的外排 近年來有兩個(gè)方法被嘗試減少或者消除外排泵的泵出抗生素能力?

3.2.2.1 具有生物活性的外排抑制劑 具有生物活性的外排抑制劑能夠影響外排基因的表達(dá),在這種情況下,外泵促進(jìn)劑與抑制劑能夠作為研究外泵蛋白生物活性的有效工具,并且能夠?yàn)槟退幍膯栴}提供潛在的方案[24]?盡管如此,這個(gè)方法也有明顯的局限性,因?yàn)榫哂姓{(diào)節(jié)功能的分子通常不僅僅作用于一個(gè)基因靶點(diǎn),所以很可能會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)期的結(jié)果?

3.2.2.2 具有藥理活性的外排抑制劑 藥理活性抑制劑可能通過非特異性和特異性的途徑發(fā)揮作用,包括以下3個(gè)方面:①削弱能量和轉(zhuǎn)運(yùn)(僅限于間接的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,ABC蛋白家族依賴消耗ATP的主動(dòng)運(yùn)輸);②干擾外排泵活性(僅可能限于革蘭氏陰性菌和ABC蛋白家族,如MacAB-TolC);③能夠競(jìng)爭(zhēng)性或者非競(jìng)爭(zhēng)性的作用于外泵蛋白?最后一點(diǎn)是在藥物化學(xué)研發(fā)中采用最廣泛的途徑,并且許多高效的外泵抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確證[25]?

在真核細(xì)胞多藥耐藥性問題中,外泵抑制劑被廣泛研究,盡管在臨床上只有環(huán)孢菌素付諸應(yīng)用?因?yàn)檎婧思?xì)胞中的P-gp基因與一些細(xì)菌中的ABC家族蛋白如LmrA有高度同源性,所以研究中發(fā)現(xiàn)有些分子能夠同時(shí)抑制真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的外泵蛋白活性?例如,作為用真核細(xì)胞的外排泵抑制劑實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷墓ぞ咚幘S拉帕米,以及作為原核細(xì)胞的外排泵抑制劑實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷墓ぞ咚幚?二者均能夠抑制兩種外排泵的活性?所以,由天然產(chǎn)物尋找或者化學(xué)途徑合成ABC家族外泵抑制劑面臨著一個(gè)重要的挑戰(zhàn):為避免副作用,必須尋找對(duì)原核細(xì)胞具有特異性的化合物?現(xiàn)在,憑借一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型,這些問題有希望被解決?所以,當(dāng)前最多的精力集中在那些間接轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究,比如MFS(NorA),SMR(Em-rE),MATE(NorM),或者RND(MexAB-OprM),證實(shí)考慮到這些蛋白及其結(jié)構(gòu)是細(xì)菌所特有的?

綜上,為了達(dá)到克服細(xì)菌外排作用引起的耐藥性,需要收集和整合更多的外泵系統(tǒng)的三維結(jié)構(gòu),藥理功能,基因編碼和上下游調(diào)控蛋白的數(shù)據(jù)資料,并且針對(duì)來源于植物和化學(xué)合成的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞水平的大量篩選?同時(shí),將主要的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn),尤其是攝入系統(tǒng)的靶點(diǎn),選為ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,對(duì)未來發(fā)現(xiàn)新的高效低毒且具有特異性的耐藥抑制劑有著光明前景?

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(收稿日期:2015-09-07)

通訊作者:司維,E-mail:35674214@qq.com?

【中圖分類號(hào)】Q 51

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.01.036