于永慧，王 濤 綜述，宋立華 審校

(病原微生物生物安全國家重點實驗室/軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071)

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·綜 述·

4種立克次體病的疫苗研究進展*

于永慧，王 濤 綜述，宋立華△審校

(病原微生物生物安全國家重點實驗室/軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071)

立克次體； 流行性斑疹傷寒； 落基山斑點熱； 恙蟲?。?Q熱； 疫苗

立克次體是一大類專性真核細胞內(nèi)寄生的原核微生物，常呈多形性，革蘭陰性。根據(jù)第2版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》，立克次體目分為3個科，共16個屬。多種立克次體是重要的人獸共患病原體，廣泛分布于世界各地。立克次體可通過媒介昆蟲的叮咬、排泄物、氣溶膠進行傳播。由于與媒介生物聯(lián)系密切，此類傳染病通常與戰(zhàn)爭、貧窮和落后衛(wèi)生條件相關(guān)。隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展，立克次體病在我國已大幅降低。現(xiàn)在，立克次體病是一類新發(fā)突發(fā)傳染病，多種立克次體病如Q熱、恙蟲病等在多個地區(qū)仍是臨床常見病，有待引起更多重視。

立克次體病的防治除藥物治療、消除傳染源和消滅傳染媒介等措施外，疫苗接種(特別是針對高危人群的免疫接種)也是重要手段。本文簡要綜述4種立克次體病(流行性斑疹傷寒、落基山斑點熱、恙蟲病和Q熱)的疫苗研究現(xiàn)狀。其中，流行性斑疹傷寒在我國已基本滅絕，落基山斑點熱僅限于美洲地區(qū)，這2種疾病與戰(zhàn)爭和生物恐怖關(guān)系密切，在我國有新發(fā)或重新流行的可能。恙蟲病和Q熱是我國常見病。Q熱的病原體(貝氏柯克斯體)現(xiàn)已歸類到軍團菌目柯克斯體屬，但在我國傳統(tǒng)上仍被稱為Q熱立克次體，Q熱仍然歸類到立克次體病范疇。

1 流行性斑疹傷寒疫苗

流行性斑疹傷寒的病原體為普氏立克次體(Rp)，以人的體虱為病媒，在人與人之間進行傳播，往往引起大流行。Rp致病性強，常與戰(zhàn)爭、貧窮、落后衛(wèi)生條件相關(guān)，是經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑。該病主要癥狀和體征是發(fā)熱、劇烈頭痛和皮疹，常見中耳炎、腮腺炎及細菌性肺炎等并發(fā)癥[1]。隨著殺蟲劑的普及和衛(wèi)生條件的提高，該病在我國已基本滅絕，但在世界貧窮落后地區(qū)仍然流行。

1.1 滅活疫苗 1930年有學(xué)者研制流行性斑疹傷寒虱腸疫苗，曾在第二次世界大戰(zhàn)期間廣泛應(yīng)用，能減輕癥狀、降低發(fā)病率，但疫苗生產(chǎn)需要大量培養(yǎng)人虱，具有一定危險性。1941年改良了用小鼠肺制備傷寒疫苗的技術(shù)，感染Rp的小鼠肺組織經(jīng)過甲醛滅活、密度梯度離心分離得到疫苗。前蘇聯(lián)科學(xué)家應(yīng)用此法生產(chǎn)疫苗，但效果不理想，疫苗尚不足以保護工作人員免于實驗室內(nèi)的接觸感染。同期，采用雞胚卵黃囊培養(yǎng)Rp制成雞胚疫苗的方法被眾多國家采納，例如美國曾在第二次世界大戰(zhàn)時期大量生產(chǎn)雞胚疫苗。此種疫苗不能使人免于感染，但能減輕癥狀、縮短病程、避免因病死亡[2]，其在制備方法、立克次體含量和效力測定標準、抗原成分等方面存在諸多問題，之后被其他類型疫苗取代。

1.2 減毒活疫苗 研究者曾用牛膽汁制備莫氏立克次體(Rt)減毒苗，Rt與Rp有相似性，Rt免疫人群后能夠激發(fā)廣泛的免疫反應(yīng)，對流行性斑疹傷寒和地方性斑疹傷寒能產(chǎn)生交叉保護力，但不同批次的疫苗功效差異大，疫苗成分難以定量，存在毒力恢復(fù)的情況[3]。第二次世界大戰(zhàn)至20世紀70年代，Rp減毒株(如Madrid E株)曾廣泛應(yīng)用。該減毒株由雞胚傳代強毒株11次后分離得到，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，對豚鼠和猴不致病且保持免疫原性。94%的接種者在14個月內(nèi)可免于流行性斑疹傷寒的自然感染。志愿者在接種后3年內(nèi)接受強毒株攻毒，96%能夠避免感染，在接種后的4～5年內(nèi)仍有83%具有保護力。但個別志愿者的接種部位出現(xiàn)紅腫、淋巴結(jié)炎，或出現(xiàn)低熱、頭痛等不良反應(yīng)，此反應(yīng)有時為速發(fā)型，有時為遲發(fā)型。20世紀70年代，研究者在豚鼠上分離到毒力恢復(fù)突變體，該疫苗逐漸停止應(yīng)用[4]。

1.3 亞單位疫苗 由于傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗存在許多不足，有學(xué)者提出利用可溶性表面蛋白與糖蛋白抗原研制亞單位疫苗，這些可溶性抗原具有免疫原性與保護性。豚鼠實驗表明，Rp可溶性蛋白中的不耐熱及種特異組分與保護性有關(guān)，純化的Rt種特異蛋白(不含脂多糖)成為傷寒疫苗的候選。動物實驗表明，純化的Rt可溶性蛋白組分既能預(yù)防流行性斑疹傷寒，也能預(yù)防地方性斑疹傷寒，是一種復(fù)合型傷寒疫苗[5]。然而，直接從Rp或Rt中大量提取種特異性抗原非常困難，難以控制成本并進行標準化生產(chǎn)，且危險性高。此外，不正確的折疊和低甲基化會降低蛋白免疫原性。分子生物學(xué)技術(shù)出現(xiàn)后，重組亞單位疫苗成為研究熱點，關(guān)注點主要集中在膜蛋白的克隆表達及在動物模型上重組亞單位疫苗的可行性[6]。

2 落基山斑點熱疫苗

落基山斑點熱的病原體為立氏立克次體(Rr)，由蜱傳播。Rr在斑點熱群立克次體中感染性和致病力最強，被列入生物戰(zhàn)劑清單。落基山斑點熱的特征是突然起病、頭痛、寒顫、發(fā)燒，四肢出現(xiàn)皮疹并波及軀干部，嚴重時可發(fā)生昏迷、休克及腎衰竭[7]。該病目前僅發(fā)生在美洲地區(qū)。隨著國際交往的逐年增多，傳染病已成為全球的共同威脅，Rr也有傳播到我國的可能性。

2.1 滅活疫苗 落基山斑點熱滅活疫苗是最早的立克次體疫苗之一。學(xué)者用Rr感染蜱，分離蜱的內(nèi)臟后用苯酚滅活制成疫苗。這種疫苗應(yīng)用于發(fā)病率低、病死率高的地區(qū)，可減輕癥狀、降低病死率；而應(yīng)用在發(fā)病率高、病死率低的地區(qū)，則可以降低發(fā)病率。隨后，有學(xué)者用雞胚卵黃囊法培養(yǎng)Rr，經(jīng)苯酚與甲醛滅活后制成疫苗。蜱和雞胚培養(yǎng)法制備的2種疫苗在動物實驗中誘導(dǎo)產(chǎn)生相似水平的免疫力；在人體試驗中均不能保護接種者免于感染，但延長了疾病的潛伏期，略微縮短了發(fā)病期。有學(xué)者用雞胚成纖維細胞培養(yǎng)和蔗糖密度梯度離心法純化Rr菌體，研制甲醛滅活Rr疫苗。這種疫苗在動物上有一定免疫效果，接種人后也誘發(fā)抗原特異性體液和細胞免疫應(yīng)答，但在安慰劑對照、雙盲試驗中發(fā)現(xiàn)疫苗產(chǎn)生的保護力不夠[8]。

2.2 減毒活疫苗 傳統(tǒng)上Rr的培養(yǎng)和遺傳操作比較困難，其減毒疫苗一直是研究空白。改進的Rr分離培養(yǎng)方法和新出現(xiàn)的遺傳學(xué)操作技術(shù)為研制Rr減毒苗提供了可能。

2.3 亞單位疫苗 由于早期的落基山斑點熱滅活苗保護力低，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的保護性免疫，學(xué)者逐漸轉(zhuǎn)向Rr亞單位疫苗的研究。Rr外膜蛋白OmpA與OmpB是感染初期主要的免疫原，也是主要的Rr亞單位疫苗候選，可誘導(dǎo)保護性免疫。重組OmpA的N末端能夠部分保護豚鼠抵抗致死劑量的Rr。OmpA與OmpB的基因也已用于研制DNA疫苗。DNA初次免疫與相應(yīng)多肽加強免疫的策略可產(chǎn)生部分對康氏立克次體的保護性，且比單一組分單獨免疫更加有效，但產(chǎn)生這種保護性的機制目前尚不清楚[9]。盡管如此，這種免疫策略不能誘導(dǎo)長效可靠的免疫力，對落基山斑點熱的保護效果有限。

3 恙蟲病疫苗

恙蟲病的病原體為恙蟲病東方體(Ot)，在恙螨和許多動物中廣泛存在，具有典型的自然疫源性。恙蟲病臨床表現(xiàn)為突發(fā)高熱、淺表淋巴結(jié)腫大、蟲咬潰爛、皮疹等，在亞太地區(qū)發(fā)病率較高，是東南亞地區(qū)重要的傳染病[10]。Ot不屬于生物戰(zhàn)劑，但與東南沿海地區(qū)的軍事行動關(guān)系密切，如美國軍隊在第二次世界大戰(zhàn)島嶼作戰(zhàn)期間曾因Ot感染造成大面積非戰(zhàn)斗減員。

3.1 滅活疫苗 對于恙蟲病疫苗的研究開始較早，研究者曾采用鼻腔、腹腔、靜脈接種法將Ot適應(yīng)于小白鼠、棉鼠、大白鼠的蜱、肺及腹膜等組織，以提高Ot繁殖量來研制疫苗。有學(xué)者取脾、肺組織制成甲醛疫苗；也有學(xué)者采用組織培養(yǎng)法加甲醛滅活，經(jīng)凍融處理制成疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，Ot滅活疫苗在動物上可產(chǎn)生對同株Ot的免疫力，而對異株的免疫力較低。美國軍隊曾在緬甸駐軍中試驗過恙蟲病鼠肺疫苗，疫苗接種組與未接種組比較，恙蟲病的發(fā)病率和病死率沒有顯著區(qū)別[11]，說明恙蟲病滅活疫苗雖然能對動物產(chǎn)生一定的保護，但人體免疫效果并不理想。

3.2 減毒活疫苗 有學(xué)者采用γ射線照射獲得了一株Ot減毒株，此減毒株保留了細胞感染能力，但對BALB/c小鼠不具有致病性。與甲醛滅活疫苗比較，射線減毒疫苗在小鼠實驗中能夠?qū)Ξ愔闛t產(chǎn)生更好的保護力。在評價疫苗長效保護力的實驗中，射線減毒疫苗對同株Ot的保護力可持續(xù)1年，而對異株Ot的保護力在6個月時就已經(jīng)不明顯[12]。射線減毒疫苗的缺點是難以標準化生產(chǎn)及儲存。

3.3 亞單位疫苗 對于恙蟲病亞單位疫苗的研究，多集中在22、47、56、58、110×103蛋白抗原。56×103蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白的重組融合蛋白，既可作為有效的免疫診斷試劑，也能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細胞免疫[13]。47×103蛋白的基因與多肽聯(lián)合免疫小鼠能同時誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性體液免疫和細胞免疫[14]。已有的動物實驗表明，Ot亞單位疫苗值得進行進一步研究。

4 Q熱疫苗

Q熱的病原體為貝氏柯克斯體(Cb)，臨床一般無顯著特征，常與其他熱性傳染病難以區(qū)別。急性Q熱表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等。慢性Q熱表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎、肉芽腫性肝炎、骨髓炎等。動物感染后出現(xiàn)食欲不振、體質(zhì)量下降、不孕、流產(chǎn)、死胎等。雖然抗菌藥物治療對Q熱有效，但慢性Q熱治療周期長，容易復(fù)發(fā)，疫苗接種是防治Q熱的最有效手段[15]。

4.1 滅活疫苗 最早研制的Q熱疫苗是為了控制Cb在動物中的感染流行。澳大利亞學(xué)者用甲醛滅活Cb作為疫苗，免疫豚鼠后能抵御其他Cb菌株的感染，免疫牛羊后可防止實驗室和自然感染Cb。澳大利亞甲醛滅活疫苗Q-Vax是唯一被許可的人用Q熱疫苗，可有效保護動物接觸者等Q熱高危人群。但該疫苗會引起較重不良反應(yīng)，包括皮疹、發(fā)熱、頭痛、接種部位腫塊等，曾感染或接種過Q熱疫苗者的不良反應(yīng)更嚴重，因此接種前需要做皮試篩選[16]。此外，該疫苗的生產(chǎn)需要在生物安全三級以上實驗室內(nèi)進行，這與皮試篩選共同增加了該疫苗大范圍免疫的難度。

4.2 減毒活疫苗 通過在豚鼠和小鼠中反復(fù)傳代，俄羅斯學(xué)者獲得了CbGrita減毒株M-44，免疫豚鼠、小白鼠、家兔后可產(chǎn)生牢固的免疫力，能承受強毒的攻擊。口服、劃痕或皮下一次免疫人體均能產(chǎn)生較高的抗體滴度，且不良反應(yīng)發(fā)生率低，即使患過Q熱或血清學(xué)呈陽性反應(yīng)，接種疫苗后也不出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)。然而，動物實驗中發(fā)現(xiàn)毒株在組織中長期存在，有毒力恢復(fù)的風險[17]。

4.3 亞單位疫苗 Q熱亞單位疫苗主要有氯仿-甲醇提取后的Ⅰ相Cb殘存物(CMR)、Ⅰ相Cb的三氯乙酸提取物(TCAE)和Ⅰ相Cb脂多糖(LPSI)。CMR不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Cb特異性保護免疫，還能刺激產(chǎn)生高水平的非特異性免疫[18]。與滅活疫苗比較，CMR具有相同水平的免疫保護力，不良反應(yīng)發(fā)生率顯著降低。TCAE與LPSI免疫小鼠后，都能產(chǎn)生較高滴度的抗體，且LPSI抗體主要出現(xiàn)于急性患者的恢復(fù)期和慢性患者中，提示LPSI可能適用于預(yù)防慢性Q熱[19]。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，基因工程重組亞單位疫苗自20世紀末起成為研究熱點。研究較多的Cb保護性抗原有27、30、34、67×103及熱休克蛋白等，上述均為Q熱亞單位疫苗成分候選。

5 小 結(jié)

自1916年普氏立克次體被首次命名，已過去近1個世紀，立克次體學(xué)家對安全高效人用立克次體疫苗的研究仍在探索中。對3個專性細胞內(nèi)寄生立克次體——Rp、Rr、Ot的滅活疫苗研究一致發(fā)現(xiàn)，不論采用何種培養(yǎng)方法，高度純化的全菌抗原雖然在動物上有時可誘導(dǎo)堅固的保護性免疫，但是僅能刺激人體產(chǎn)生部分保護，不能誘導(dǎo)無菌保護性免疫。對這3個菌種的亞單位疫苗研究受限于菌體的培養(yǎng)純化。對三者的重組亞單位疫苗研究在動物模型上已取得了可喜進展，但還沒有相關(guān)臨床試驗研究。盡管還沒有理想的疫苗，前期研究已發(fā)現(xiàn)Rp與Ot的減毒活疫苗可誘導(dǎo)堅固的保護性免疫，這與其他病原減毒活疫苗的高效性相一致。隨著立克次體遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，定向改造的減毒活疫苗有望成為新的研究熱點。

本文涵蓋的4種立克次體病中，Cb導(dǎo)致的Q熱是特例。目前，Cb仍被認為是專性胞內(nèi)寄生菌，但無生命培養(yǎng)基的出現(xiàn)已使Cb“專性胞內(nèi)寄生”的標簽受到質(zhì)疑。與Rp、Rr和Ot不同，Cb滅活疫苗和亞單位疫苗均可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生長效保護性免疫，此疫苗的主要缺點是Cb培養(yǎng)純化離不開高級別生物安全實驗室。目前，有2種策略可望解決Cb疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的難點：重組表達保護性抗原或保護性抗原表位，采用遺傳學(xué)方法將Cb減毒以解除其高級別生物安全的要求。總之，Cb與Rp、Rr、Ot代表了一大類生物學(xué)性狀相似的專性胞內(nèi)寄生菌，對它們的疫苗研究不僅有助于疾病防控，也有可能為其他疾病防控提供工具或思路，新近發(fā)展迅速的立克次體遺傳學(xué)改造技術(shù)將在立克次體疫苗研制中發(fā)揮重要作用。

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病原微生物生物安全國家重點實驗室開放課題(SKLPBS1409)?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.026

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1673-4130(2016)22-3162-03

2016-07-05

2016-09-11)