陳健媚，郭姣

?

中藥血清藥理學(xué)研究進展

陳健媚，郭姣

（廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院/廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東 廣州510006）

摘要：隨著中藥血清藥理學(xué)的不斷發(fā)展，國內(nèi)許多學(xué)者都采用血清藥理學(xué)方法進行中藥復(fù)方的研究，并取得一定的進展。本文對中藥血清藥理學(xué)實驗動物的選擇、給藥方案、采血方案、血清滅活與保存、對照組的設(shè)定與血清的添加量、中藥血清藥理學(xué)研究應(yīng)用現(xiàn)狀進行了綜述，闡明血清藥理學(xué)在中藥體外藥效研究中的重要性，為今后相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥；血清藥理學(xué)；體外實驗；藥效學(xué)

中藥血清藥理學(xué)是將中藥經(jīng)口給動物灌服，一定時間后采集動物血液、分離血清，用此含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種實驗方法［1］。

中藥尤其是粗制劑中含有較多的雜質(zhì)，其作用于人體的具體成分并不完全清楚。既往中藥藥理體外實驗多將中藥復(fù)方粗提物直接加到體外細胞反應(yīng)體系中，但是中藥粗提物中的雜質(zhì)、滲透壓、酸堿度等對細胞產(chǎn)生干擾［2］；中藥經(jīng)胃腸道和肝臟代謝后，其原有成分或失活，或轉(zhuǎn)化成其他活性成分，或借助于機體的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)而發(fā)揮作用，所以中藥粗提物的成分并不能真正代表體內(nèi)發(fā)揮作用的有效成分［3］。中藥血清藥理學(xué)方法能夠反映中藥在胃腸道消化吸收，在肝藥酶作用下的代謝及最后產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實結(jié)果，使體外實驗?zāi)M了體內(nèi)過程，達到了體外實驗?zāi)軌蚍从乘幬矬w內(nèi)真實狀態(tài)的目的。本文就中藥血清藥理學(xué)的研究方法及其應(yīng)用作一概述，為今后相關(guān)研究提供參考。

1 中藥血清藥理學(xué)研究方法

1.1 實驗動物的選擇

中藥血清藥理學(xué)的精髓就在于巧妙地利用了生物體對中藥復(fù)雜成分的選擇和過濾作用，使復(fù)雜研究得以簡化。因為在不適當(dāng)?shù)膭游锷砩祥_展實驗，?？蓪?dǎo)致實驗結(jié)果的不可靠性，而且直接關(guān)系到中藥血清藥

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-25 15：12 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160425.1512.001.html理學(xué)研究的成敗和質(zhì)量，所以實驗動物的選擇是研究工作中的一個重要環(huán)節(jié)。中藥血清藥理學(xué)研究工作中實驗動物的選擇，首先應(yīng)根據(jù)受試藥物、實驗?zāi)康暮鸵筮M行選擇，其次考慮是否經(jīng)濟、容易獲得、容易飼養(yǎng)和管理等情況再進行確定。目前，家兔、大鼠、豚鼠是用來制備含藥血清的常用實驗動物［4］。

1.2 給藥方案及采血時間

邢作英課題組使用高效液相色譜法分析大鼠含藥血清的成分及含量，確定動物的最佳給藥劑量為臨床等效劑量的5倍［5］。但是楊彥芳等［6］認為通過高劑量給藥制備的血清，所得的陽性結(jié)果在下結(jié)論時應(yīng)慎重或留有余地。也有學(xué)者認為動物體內(nèi)給藥量與含藥血清的效應(yīng)并無明顯的量效關(guān)系［7］。在實際應(yīng)用中，更推崇以臨床等效劑量為基礎(chǔ)，通過預(yù)實驗摸索最佳的動物給藥劑量，不能一概而論。

中藥成分復(fù)雜，各成分的藥動學(xué)參數(shù)各異，很難采用統(tǒng)一的標(biāo)準設(shè)計給藥次數(shù)與采血時間。目前有3種經(jīng)驗給藥方案［8］：①連續(xù)給藥7～10 d，每天給藥1次；②只給2次藥，第1次給藥2 h后以相同劑量再給藥1次；③連續(xù)給藥3次，第1、2次間隔20 h，第2、3次間隔4 h。李儀奎等［9］通過對大量已知中藥的藥代學(xué)動力學(xué)參數(shù)進行分析后，提出含藥血清藥理學(xué)動物給藥通法：每天給藥2次，連續(xù)3 d，末次給藥后1 h進行采血。最佳的采血時間應(yīng)在穩(wěn)態(tài)血藥濃度期間，一般在末次給藥后1～2 h進行采血［10］。

1.3 血清滅活與保存

血清中含有多種抗體、補體及其他生物活性物質(zhì)，它們對體外培養(yǎng)的細胞、病毒、病原菌以及用于體外實驗的組織器官可能產(chǎn)生影響而干擾實驗結(jié)果，影響藥物療效的客觀評價。通常會對血清進行滅活處理。目前有3種滅活方法［11］：①乙醇法，即加入4～5倍95%乙醇于血清中，混勻，3 000 r/min離心后取上清于溫水浴中把乙醇蒸發(fā)掉；②丙酮法：向血清中加入4～5倍量丙酮，混勻，3 000 r/min離心后取上清于溫水浴中把丙酮蒸發(fā)掉；③加溫法：即56℃水浴30 min。但是對血清進行滅活是否即可排除干擾因素對實驗結(jié)果的影響仍存在爭議。韓仕慶等［12］的研究表明，滅活后的丹參含藥血清可通過調(diào)控瘦素刺激的大鼠肝星狀細胞中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶2的表達，從而抑制肝星狀細胞的活化增殖。吳健宇等［13］發(fā)現(xiàn)血清滅活后對細胞的毒性作用明顯減小，可加大血清的添加量。但是也有學(xué)者在進行含藥血清抑制血小板釋放5-HT和阻滯內(nèi)皮細胞鈣離子通道兩項實驗中發(fā)現(xiàn)，血清滅活過程中所除去的生物活性物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響不大［14］。也有滅活后功效下降的報道［15］。李平等［16］的研究表明，宜使用新鮮未滅活血清進行體外抑菌實驗，如要排除血清中蛋白成分的作用，可選用滅活血清。

含藥血清經(jīng)長期低溫保存后藥效可顯著降低［14］，提示含藥血清中的有效成分在保存過程中會發(fā)生變化，即使低溫冷凍保存仍影響其藥效。因此為了保證含藥血清的質(zhì)量，宜使用新鮮的含藥血清，如必須滅活，也應(yīng)使用新鮮滅活的血清，且不要長時間保存［4］。1.5 對照組的設(shè)定與血清的添加量

為了避免血清本身具有的活性給實驗結(jié)果帶來的影響，必須設(shè)立空白血清作為對照組。如果以一種劑量給予動物，以不同體積的含藥血清作為不同劑量組，則應(yīng)以相應(yīng)的不同體積空白血清作為對照組，而且在數(shù)據(jù)處理時以實際測得數(shù)據(jù)表示；如果以不同劑量的受試藥物給予動物，取同體積的血清作為不同藥物劑量組，則只需設(shè)立一組等體積空白血清作為對照組即可［10］。

對于血清添加量，目前還沒有確切規(guī)定。血清濃度過高可能對細胞產(chǎn)生毒性，有學(xué)者建議通過改變動物的給藥量來調(diào)整血清中藥物濃度，從而固定血清的添加體積［17］。也有學(xué)者認為，如果選擇與體外器官或細胞種屬接近的動物制備含藥血清，可以使用100%的血清對體外體系進行培養(yǎng)，但同時也指出，此方法并非適用所有體系［18］。此外，以5%、10%、25%作為血清的添加量也見報道［19-21］。血清添加量的確定，應(yīng)多參考文獻，根據(jù)預(yù)實驗選擇一個合適的添加量，在使血清中的藥物濃度接近于血藥濃度的同時避免血清對細胞產(chǎn)生毒性，從而較客觀地反映中藥的整體藥效［22］。

2 中藥血清藥理學(xué)研究應(yīng)用現(xiàn)狀

中藥血清藥理學(xué)方法作為一種實驗技術(shù)，在中醫(yī)藥學(xué)實驗研究上已被逐漸應(yīng)用，如中藥含藥血清對心血管系統(tǒng)、抗腫瘤作用、神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎及免疫作用的研究等。

2.1 中藥含藥血清對心血管系統(tǒng)的研究

劉竹青等［23］通過實驗表明：桃紅四物湯大鼠含藥血清可改善H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷，顯著提高細胞內(nèi)SOD活力、降低MDA和LDH含量，抑制Caspase-3蛋白表達。邱宇安等［24］發(fā)現(xiàn)黃芪大鼠含藥血清可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞株ECV-304的凋亡，促進HSP70表達。歐陽長生等［25］使用新西蘭大耳兔制備丹參和血府逐瘀湯含藥血清并分別作用于兔骨髓間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)丹參和血府逐瘀湯含藥血清均能促進兔骨髓間充質(zhì)干細胞的體外遷移和增殖，且效果相當(dāng)，并發(fā)現(xiàn)其機制可能與升高血清間質(zhì)細胞衍生因子1的含量直接相關(guān)。

2.2 中藥含藥血清抗腫瘤作用的研究

Cao等［26］發(fā)現(xiàn)菝葜大鼠含藥血清可直接抑制人肝癌細胞系SMMC-7721增殖并誘導(dǎo)其凋亡。菝葜含藥血清刺激細胞后，S+G2/M期細胞增加，但是G0/G1期細胞減少，此現(xiàn)象與菝葜含藥血清抑制細胞DNA聚合酶 δ催化亞基基因 1（DNA polymerase δ catalytic subunit gene 1，POLD1）表達有關(guān)。盛慶壽等［27］制備雙氫青蒿素大鼠含藥血清并作用于人肝癌細胞系SMMC-7721，發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素含藥血清抑制肝癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并進一步發(fā)現(xiàn)此效應(yīng)與雙氫青蒿素含藥血清抑制細胞血管內(nèi)皮生長因子有關(guān)。馮文茹等［28］選擇4個體內(nèi)抗癌試驗有效的中藥復(fù)方制劑進行體內(nèi)及血清藥理學(xué)的試驗，發(fā)現(xiàn)此4種中藥復(fù)方制劑的含藥血清同樣具有抗癌活性。

2.3 中藥含藥血清對神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究

Yang等［29］通過 HPLC-DAD-MS檢測出補陽還五湯大鼠含藥血清中含有毛蕊異黃酮、芒柄花黃素等9個代謝產(chǎn)物。Sun等［30］進一步使用補陽還五湯大鼠含藥血清作用于胚胎海馬神經(jīng)前體細胞，結(jié)果顯示補陽還五湯含藥血清刺激后的神經(jīng)前體細胞具有更長的神經(jīng)突，此外具有神經(jīng)絲的細胞和表達膠質(zhì)纖維酸性蛋白的細胞數(shù)量增多，細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著下降，說明補陽還五湯含藥血清可促進神經(jīng)前體細胞的增殖和分化。余鵬等［31］運用血清藥理學(xué)的方法和細胞外谷氨酸濃度測定法，發(fā)現(xiàn)補陽還五湯含藥血清可上調(diào)缺氧復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞GLT-1和GS表達，提示補陽還五湯可能通過上調(diào) GLT-1、GS表達，促進缺氧復(fù)氧后谷氨酸的轉(zhuǎn)運，從而抗腦缺血損傷。

2.4 中藥含藥血清抗炎及免疫作用的研究

唐鋒等［32］利用血清藥理學(xué)方法探討麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的作用，發(fā)現(xiàn)麻黃附子細辛湯各時間點大鼠含藥血清均能降低抗原誘導(dǎo)的RBL-2H3細胞系組胺的釋放，而且麻黃附子細辛湯15，30 min的含藥血清能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細胞增殖。黃卓堅等［33］發(fā)現(xiàn)10%、5%的白背葉根小鼠含藥血清可顯著抑制LPS誘導(dǎo)下RAW264.7細胞系中LTB4的分泌，2.5%的白背葉根含藥血清可顯著抑制IL-β的分泌，因此得出白背葉根的抗炎機制可能是通過抑制炎癥反應(yīng)中NO、LTB4、IL-1β的釋放而實現(xiàn)的結(jié)論。趙艷等［34］發(fā)現(xiàn)腎康丸含藥血清能通過p38MAPK/NF-κB途徑下調(diào)足細胞的MCP-1表達發(fā)揮抗炎作用，為腎康丸應(yīng)用于防治糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)。

3 評價與展望

中藥成分多樣，作用的整體性和作用機理的復(fù)雜性使得中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究進展緩慢。運用血清藥理學(xué)的方法對中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究，只要實驗設(shè)計嚴格規(guī)范，其實驗結(jié)果的可信性應(yīng)優(yōu)于粗制劑直接加入法。絕大部分的實驗結(jié)果也表明，與空白血清相比，中藥含藥血清具有一定的藥效，但是血清成分復(fù)雜，不可控因素多，導(dǎo)致了實驗結(jié)果的重復(fù)性差。但隨著分離和分析手段的不斷提高，中藥血清藥理學(xué)研究得到進一步的發(fā)展及完善。另外，中藥血清藥理學(xué)必須與中藥血清藥物化學(xué)、檢測鑒定醫(yī)學(xué)、血清成分藥效學(xué)等相關(guān)學(xué)科相結(jié)合，才能更科學(xué)、更客觀地分析中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效規(guī)律，為中藥質(zhì)量標(biāo)準的制定、中藥新藥的開發(fā)提供新方法。相信隨著相關(guān)技術(shù)的日益成熟，中藥血清藥理學(xué)將會更好地在科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮作用。

參考文獻：

［1］姜振，莊朋偉，張艷軍.中藥復(fù)方血清藥理學(xué)及其在藥效評價中的應(yīng)用［J］.齊魯藥事，2010，29（2）：96-98.

［2］薛潔，謝梅林.中藥血清藥理學(xué)的方法學(xué)研究近況［J］.中草藥，2003，34（6）：9-11.

［3］師少軍，陳匯，曾繁典.中藥復(fù)方藥物代謝動力學(xué)研究方法及展望［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2001，17（3）：235-238.

［4］黃臣虎，陸茵，高驍君，等.中藥血清藥理學(xué)研究進展［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：266-271.

［5］邢作英，王永霞，曹英杰，等.血清藥理學(xué)研究概要［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（1）：219-222.

［6］楊彥芳，王玉芹.中藥復(fù)方血清藥理學(xué)方法規(guī)范化探討［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20（5）：380-382.

［7］劉建勛，韓笑，孫宇揚.含藥血清藥理作用強度與體內(nèi)給藥的量效、時效關(guān)系研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（10）：829-831.

［8］張靈娜，林兵，宋洪濤.中藥血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)的研究概況及展望［J］.中草藥，2015，46（17）：2662-2666.

［9］李儀奎，吳健宇.血清藥理實驗中采血時間的通法方案［J］.中國藥理學(xué)通報，1999，15（6）：569-570.

［10］李儀奎.中藥血清藥理學(xué)實驗方法的若干問題［J］.中藥新藥與臨床藥理，1999，10（2）：95-98.

［11］王睿.中藥血清藥理學(xué)研究進展［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，27（18）：2243-2244.

［12］韓仕慶，王海蘭，馮藜櫪，等.丹參含藥血清對肝星狀細胞Hh通路中SuFu和DYRK2表達的影響［J］.中國中藥雜志，2015，40（22）：4469-4474.

［13］吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理實驗中異種動物血清對細胞的毒性作用和滅活后的減毒作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2000，16 （1）：118-119.

［14］周明眉，楊奎，姜遠平，等.中藥血清藥理學(xué)的方法學(xué)研究──含藥血清低溫保存和血清滅活的影響［J］.中藥藥理與臨床，1999，15（2）：44-46.

［15］陰赪宏，李蘭芳，金亞宏，等.滅活對當(dāng)歸補血湯含藥血清抑制小鼠肝組織過氧化脂質(zhì)生成作用的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2000，7（2）：23-24.

［16］李平，楚更五，周華，等.蜂膠左金丸含藥血清抗幽門螺桿菌的實驗研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（3）：59-60.

［17］詹紅生，趙詠芳，馮偉，等.含藥血清方法在中藥調(diào)節(jié)骨與軟骨代謝基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用［J］.中國骨傷，2000，13（11）：661-662.

［18］吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理學(xué)方法體外實驗系統(tǒng)的血清添加量問題［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2001（9）：8-11.

［19］鄧悅寧，周達岸，陳丹.補腎益髓中藥含藥血清誘導(dǎo)BMSC骨向分化作用機制的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（7）：1697-1700.

［20］包金風(fēng)，劉國卿，李子中.腦力智寶對PC12細胞缺血性損傷的保護作用［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2000，31（2）：126-129.

［21］李然，劉立萍，馬驥，等.小柴胡湯含藥血清對肝癌HepG-2細胞的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（5）：217-220.

［22］王霖，張云，汪受傳.中藥血清藥理學(xué)研究中含藥血清添加量問題的商榷［J］.山西中醫(yī)，2006，22（1）：51-52.

［23］劉竹青，尹登科，韓嵐，等.桃紅四物湯含藥血清對過氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用［J］.中國中藥雜志，2013，38（3）：402-406.

［24］邱宇安，黃紹烈，陳火國，等.黃芪含藥血清對血管內(nèi)皮細胞的保護作用及機制［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（30）：108-110.

［25］歐陽長生，王云開，蘇海，等.丹參及血府逐瘀湯含藥血清與兔骨髓間充質(zhì)干細胞的體外遷移：促進還是抑制？［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（40）：7847-7851.

［26］CAO Bo，ZHANG Zihan，ZHANG Yuqin，et al.Effect of Smilax china L.-containing serum on the expression of POLD1 mRNA in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Exp&Ther Med，2013，6（4）：1070-1076.

［27］盛慶壽，王武，郭洪武，等.雙氫青蒿素含藥血清抑制人肝癌SMMC-7721細胞活性的研究［J］.中藥藥理與臨床，2015，31 （1）：40-43.

［28］馮文茹，趙秀梅，沈洪昇，等.中藥方劑體內(nèi)及含藥血清抗腫瘤作用的比較［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009（6）：1230-1232.

［29］YANG Donghui，CAI Shaoqing，LIU Hongyu，et al.On-line identification of the constituents of Buyang Huanwu decoction in pig serum using combined HPLC-DAD-MS techniques［J］.J Chromat B，2006，831（1/2）：288-302.

［30］SUN Jinhao，BI Yushun，GUO Lihua，et al.Buyang Huanwu Decoction promotes growth and differentiation of neural progenitor cells：Using a serum pharmacological method［J］.J Ethnopharm，2007，113（2）：199-203.

［31］余鵬，關(guān)莉，劉微，等.補陽還五湯含藥血清對星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體1和谷氨酰胺合成酶的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，32（2）：267-384.

［32］唐鋒，梁少瑜，陳飛龍，等.血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)相結(jié)合的方法探討麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的物質(zhì)基礎(chǔ)［J］.中國中藥雜志，2015，40（10）：1971-1976.

［33］黃卓堅，王志萍，夏星，等.白背葉根含藥血清對脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細胞分泌的影響［J］.廣西中醫(yī)藥，2015，38（1）：62-66.

［34］趙艷，王建成，李紅瑜，等.腎康丸通過p38/NF-κB通路抑制AOPP誘導(dǎo)的足細胞炎癥因子MCP-1的表達［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，34（9）：1265-1271.

（責(zé)任編輯：王昌棟）

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0390-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016012403

收稿日期：2016-01-24

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81173626）

作者簡介：陳健媚（1989—），女，2013級碩士研究生，從事中藥活性成分研究與新藥研發(fā)，Email：jimmygpu@163.com；通信作者：郭姣（1961—），女，博士，教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治糖脂代謝病研究，Email：jiaoguo_gdpu@hotmail.com。

Progress on the serum pharmacology of Chinese medicine

CHEN Jianmei，GUO Jiao
（Institute of Chinese Medical Science，Guangdong Pharmaceutical University，Guangdong Metabolic Diseases Research Center of integrated Chinese and Western Medicine，Guangzhou 510006，China）

Abstract：With the development of serum pharmacology，many domestic scholars have adopted the methods of serum pharmacology on the study of traditional Chinese medicine，and made some progress.This paper mainly discusses about the selection on animals，dosage regimen，blood sampling regime，serum inactivation and storage，the control group establishment and serum addition，as well as the current situation of serum pharmacology，which illustrates the importance of serum pharmacology on the study of traditional Chinese medicine and provides a reference for related studies.

Key words：traditional Chinese medicine；serum pharmacology；in vitro experiment；pharmacodynamics