梅　黎，　汪　洋，　李　飛，　李　平，　蘇　偉△，　張凱倫△，　劉曉斌

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢　430022

2安徽省立醫(yī)院心血管外科，合肥　230001

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論著

脂多糖通過上調長正五聚蛋白3的表達參與鈣化性主動脈瓣膜病的發(fā)生發(fā)展過程*

梅黎1#，汪洋1，2#，李飛1，李平1，蘇偉1△，張凱倫1△，劉曉斌1

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢430022

2安徽省立醫(yī)院心血管外科，合肥230001

摘要：目的探討脂多糖(LPS)上調主動脈瓣膜間質細胞(AVICs)表達長正五聚蛋白3(PTX3)，在鈣化性主動脈瓣膜病(CAVD)發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法體外培養(yǎng)AVICs，用不同濃度LPS(0、50、100、200 ng/mL)干預AVICs 48 h，蛋白免疫印跡法檢測PTX3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)、骨橋蛋白(OPN)的表達；采用PTX3靶向小干擾RNA(PTX3 siRNA)轉染AVICs沉默PTX3 72 h，蛋白免疫印跡法檢測PTX3的表達；PTX3 siRNA轉染AVICs 48 h后再給予LPS(200 ng/mL)干預AVICs，蛋白免疫印跡法檢測BMP2、OPN的表達。結果①不同濃度LPS干預AVICs表達PTX3、BMP2、OPN均呈濃度依賴性增加，LPS濃度達200 ng/mL時，PTX3、BMP2、OPN的表達與對照組比較均顯著增加(均P<0.01)；②PTX3 siRNA組與對照組比較可有效沉默PTX3的表達(P<0.01)；③與對照組比較，LPS+PTX3 siRNA組AVICs成骨因子的表達明顯減少(P<0.05)。結論LPS可刺激AVICs表達PTX3，從而促進AVICs表達BMP2、OPN，PTX3參與了CAVD的發(fā)生發(fā)展過程。

關鍵詞：鈣化性主動脈瓣膜??；長正五聚蛋白3；脂多糖

主動脈瓣膜鈣化及鈣化導致的主動脈瓣膜狹窄在臨床上均較常見。在西方國家，年齡大于65歲的成年人中，大約有2.5%的人呈現(xiàn)主動脈瓣膜不同程度的狹窄，其中一些人需要行主動脈瓣膜置換手術治療[1]。近十年來，越來越多的研究證實主動脈瓣膜鈣化并不是被動的退行性變，而是成骨樣分化的主動調節(jié)過程，其病理生理過程包括脂質沉積、慢性炎癥、瓣膜間質細胞向成骨樣細胞轉化等[2-3]。

長正五聚蛋白3(PTX3)屬于正五聚蛋白家族成員，又稱腫瘤壞死因子刺激基因14(tumor necrosis factor-stimulated gene14，TSG14)，是一種典型的急性期蛋白[4]。PTX3作為唯一的可溶性模式識別受體，可以結合多種可溶性受體配體，參與免疫防御、炎癥、細胞凋亡及多種心血管疾病[5]。研究表明，PTX3可比C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)更迅速地反映組織局部的炎癥及損傷，有望成為臨床更為敏感的血清學標志而受到重視。2010年Naito等[6]首次報道了84例因主動脈狹窄或主動脈反流而接受手術的患者，并發(fā)現(xiàn)其組織和血漿中的PTX3水平呈正相關，推測PTX3可能參與了主動脈瓣狹窄的病理生理過程，研究表明，除年齡之外，PTX3是非主動脈瓣膜狹窄型鈣化性主動脈瓣膜病的一個獨立的預測因子。目前關于PTX3在鈣化性主動脈瓣膜病(CAVD)中的研究仍相對較少，故本研究通過脂多糖(LPS)體外干預主動脈瓣膜間質細胞(AVICs)，檢測PTX3及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP2)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)的表達變化。通過沉默PTX3，用LPS干預以觀察PTX3對AVICs表達成骨因子的調節(jié)作用，探討其信號通路。

1材料與方法

1.1主要藥品與試劑

胎牛血清(Gibco公司)；脂多糖(Sigma公司)；PTX3抗體(Santa Cruz公司)；BMP2、OPN抗體(Abcom公司)；α-SMA、Vimentin抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)；小干擾RNA(廣州市銳博生物科技有限公司)；Opti-MEM、Lipo2000(美國Invitrogen公司)。

1.2AVICs原代分離和培養(yǎng)

按照文獻中的方法分離培養(yǎng)瓣膜間質細胞[7]，取主動脈夾層術后或心臟移植術后主動脈瓣膜，用無菌PBS反復沖洗瓣膜。將沖洗后的主動脈瓣膜置于濃度為0.2%Ⅰ型膠原酶中，37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，每10 min振蕩1次，除去上清，將剩余的瓣膜組織仍然置于0.2%Ⅰ型膠原酶中，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化12~18 h后重懸于10%胎牛血清完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長后，適時傳代培養(yǎng)，每2~3 d換液1次，取2~5代細胞用于實驗。

1.3AVICs免疫熒光鑒定

消化AVICs接種于6孔板載玻片上，待細胞密度達60%~70%融合度時，終止細胞培養(yǎng)，取出爬片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次；1%胎牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min；分別滴加1%BSA稀釋的一抗(Vimentin，α-SMA及vWF)，4℃過夜，PBS漂洗3次。滴加1%BSA稀釋的二抗，37℃避光孵育1 h后PBS漂洗3次。5 μg/mL DAPI染色2 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.4目的蛋白Western blot檢測

預冷的PBS清洗細胞2次，加入適量細胞裂解液，用細胞刮迅速刮下細胞，收集至EP管，振蕩，離心，收集總蛋白。取30 μg總蛋白12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉膜至PVDF膜，使用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉1 h。分別加入一抗4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。目的蛋白加入二抗，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光試劑顯影，結果使用凝膠成像分析系統(tǒng)測定，各條帶與β-actin的灰度值之比為目的蛋白表達相對含量。

1.5細胞轉染

將細胞消化后接種于6孔板，待細胞融合度達30%~50%時行細胞轉染。分別取250 μL Opti-MEM于2個EP管，其中一個EP管加入5 μL Lipo 2000(A液)，另一個EP管加入10 μL siRNA(B液)，吹打3~5次混勻，室溫放置5 min。將A液與B液混合，吹打使其充分混勻，室溫放置20 min。移除6孔板中培養(yǎng)液，加入1 500 μL Opti-MEM，并加入上述配制好的混合溶液500 μL，共計2 mL，使siRNA的終濃度為100 nmol/L，輕輕搖晃6孔板，混勻后放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。4~6 h后換液，72 h后提取總蛋白，Western blot檢測沉默效果。

1.6統(tǒng)計學分析

2結果

2.1AVICs免疫熒光鑒定

AVICs是心臟瓣膜組織中主要的細胞類型，瓣膜表面尚有少量的瓣膜內皮細胞。按上述方法分離原代細胞后，貼壁細胞中幾乎不含瓣膜內皮細胞，此外，在AVICs貼壁生長的過程中，AVICs生長迅速可抑制瓣膜內皮細胞的生長。瓣膜間質細胞呈現(xiàn)梭形或多邊形，在特異性標記物上，瓣膜間質細胞表達Vimentin及α-SMA(圖1)，圖1表明用上述方法提取的為瓣膜間質細胞。

A：抗Vimentin免疫熒光染色，Vimentin表達(+)；B：DAPI細胞核染色，呈現(xiàn)藍色；C：A與B合成圖；D：抗α-SMA免疫熒光染色，α-SMA表達(+)；E：DAPI細胞核染色，呈現(xiàn)藍色；F：D與E合成圖圖1　AVICs標記物Vimentin及α-SMA染色(×400)Fig.1 Staining of AVICs markers Vimentin and α-SMA (×400)

2.2不同濃度LPS刺激AVICs表達PTX3

Naito等[6]報道在瓣膜間質細胞中發(fā)現(xiàn)有PTX3的表達，但目前對于瓣膜間質細胞能否通過LPS的干預表達PTX3尚未見文獻報道。采用第2~4代細胞接種于6孔板中，待細胞生長至80%~90%融合度時，用不同濃度LPS(0、50、100、200 ng/mL)刺激AVICs 48 h，每組設置3個復孔，實驗經(jīng)過3次驗證，Western blot檢測PTX3的表達情況，結果顯示AVICs表達PTX3較正常培養(yǎng)組明顯增多(P<0.05)，并隨LPS濃度增加呈現(xiàn)濃度依賴性增加，LPS(100 ng/mL、200 ng/mL)較正常培養(yǎng)組顯著增多(均P<0.01)，見圖2。

2.3不同濃度LPS刺激AVICs表達成骨因子BMP2、OPN

正常瓣膜間質細胞表達少量成骨因子(BMP2、OPN)，但當瓣膜間質細胞由靜止狀態(tài)轉化為激活狀態(tài)后，細胞表達BMP2、OPN明顯增多，用不同濃度LPS(0、50、100、200 ng/mL)刺激VIC 48 h，每組設置3個復孔，實驗經(jīng)過3次驗證，Western blot檢測BMP2、OPN的表達情況，結果顯示LPS濃度為50 ng/mL時，AVICs表達BMP2較正常培養(yǎng)組明顯增多(P<0.05)，LPS(100 ng/mL、200 ng/mL)干預AVICs時，BMP2、OPN較正常培養(yǎng)組均顯著增多(均P<0.01)，見圖3。

2.4PTX3 siRNA轉染AVICs后可有效沉默PTX3

采用第2~4代細胞接種于6孔板，使接種于6孔板中的細胞密度達到30%~50%融合度，并于細胞接種達24 h左右時進行細胞轉染，按照上述方法進行細胞轉染實驗。設立空白對照組，Scramble siRNA轉染組及PTX3 siRNA轉染組，每組設置3個復孔，實驗經(jīng)過3次驗證，轉染完成后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集6孔板中蛋白，進行Western blot檢測PTX3表達情況，檢測PTX3 siRNA的沉默效果。與空白對照組及Scramble siRNA轉染組比較，PTX3 siRNA轉染組表達PTX3水平顯著減少(P<0.01)，見圖4。

A：空白對照組；B：50 ng/mL LPS干預組；C：100 ng/mL LPS干預組；D：200 ng/mL LPS干預組；*P<0.05**P<0.01圖2　不同濃度LPS干預后PTX3的表達呈劑量依賴性增加Fig.2 A dose-dependent increase of PTX3 stimulated by different concentrations of LPS

2.5LPS通過刺激AVICs表達PTX3并促進成骨因子BMP2、OPN的表達

實驗設立Scramble siRNA轉染組、100 ng/mL LPS干預組、Scramble siRNA+100 ng/mL LPS干預組、PTX3 siRNA+100 ng/mL LPS干預組，Scramble siRNA、PTX3 siRNA轉染AVICs 48 h后，給予100 ng/mL LPS干預48 h，每組設置3個復孔，實驗經(jīng)過3次驗證，收集6孔板中蛋白，進行Western blot檢測BMP2、OPN的表達情況。結果顯示(圖5)，100 ng/mL LPS干預組、Scramble siRNA+100 ng/mL LPS干預組均比Scramble siRNA轉染組表達明顯增高(均P<0.05)，而PTX3 siRNA+100 ng/mL LPS干預組較Scramble siRNA+100 ng/mL LPS干預組表達明顯減少(P<0.05)。

A、E：空白對照組；B、F：50 ng/mL LPS干預組；C、G：100 ng/mL LPS干預組；D、H：200 ng/mL LPS干預組；*P<0.05**P<0.01圖3　不同濃度LPS干預后BMP2、OPN的表達呈劑量依賴性增加Fig.3 A dose-dependent increase of BMP2 and OPN expression after treatment with different concentrations of LPS

A：空白對照組；B：Scramble siRNA轉染組；C：PTX3 siRNA轉染組；**P<0.01圖4　PTX3 siRNA可有效降低細胞內PTX3水平Fig.4 PTX3 siRNA effectively reduced cellular PTX3 levels

3討論

主動脈瓣鈣化可引起主動脈瓣狹窄、關閉不全等，從而導致血流動力學的改變，是導致老年退行性心瓣膜病的重要病理改變[8]。在生理條件下瓣膜間質細胞處于靜息狀態(tài)，當處于異常血流動力學環(huán)境或在其他病理條件刺激下，間質細胞可能向增殖、收縮甚至鈣化等表型轉化，導致瓣膜結締組織過度增生、粘連、鈣化等病理改變以及瓣膜細胞營養(yǎng)失衡等，進而引起心臟瓣膜狹窄、關閉不全等臨床表現(xiàn)，嚴重危害人類健康。

脂多糖是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，慢性牙周感染在鈣化性主動脈瓣膜病的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[9]，研究表明，在病變的主動脈瓣膜中發(fā)現(xiàn)口腔細菌，以及用口腔細菌接種實驗兔子，可誘導其產(chǎn)生主動脈瓣膜病變[10]，慢性口腔感染可能是主動脈瓣鈣化及狹窄發(fā)病的重要誘因之一。脂多糖可作用于細胞膜受體如Toll2受體或Toll4受體，并激活多種下游信號蛋白，通過多種信號通路最終上調瓣膜間質細胞成骨因子的表達，促使瓣膜間質細胞向成骨細胞表型轉化，參與鈣化性主動脈瓣膜病的發(fā)生發(fā)展過程[11-12]。

A、E：Scramble siRNA轉染組；B、F：100 ng/mL LPS干預組；C、G：Scramble siRNA+100 ng/mL LPS干預組；D、H：PTX3 siRNA+100 ng/mL LPS干預組；*P<0.05圖5　沉默PTX3后顯著降低LPS誘導的細胞內BMP2、OPN水平Fig.5 Silencing PTX3 markedly reduced cellular BMP2 and OPN levels after treatment with LPS

PTX3在炎癥剌激下，由多種細胞產(chǎn)生(主要包括DCs、巨噬細胞、成纖維細胞、活化的內皮細胞等)[13-14]。目前PTX3血漿水平異常己被證實與多種心血管及相關疾病有關[6，15-18]。有研究建立了PTX3-/-基因的小鼠模型與心臟特異性高表達PTX3的轉基因小鼠模型，經(jīng)過對其進行主動脈縮窄手術處理后發(fā)現(xiàn)，與對照組相應野生型同窩生小鼠比較，PTX3的轉基因小鼠IL-6和結締組織生長因子的產(chǎn)生增多，同時，不良心肌重塑、左心室功能障礙、心肌間質纖維化增強；而PTX3-/-小鼠反之。該研究結果表明，在后負荷增加后局部炎癥介質PTX3直接誘導心肌肥厚、左心室功能障礙，促進心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程[19]。另有研究認為，PTX3作為先天性免疫中可溶性模式識別受體，可能通過先天性免疫反應促進了動脈粥樣斑塊的進展，還可能減少單核細胞和內皮細胞表達組織因子而促進血栓形成[15]。

我們的研究通過LPS體外誘導瓣膜間質細胞，Western blot檢測PTX3及成骨因子的表達，結果發(fā)現(xiàn)其表達呈現(xiàn)濃度依賴性增加。通過構建以PTX3基因為靶向的RNA干擾重組體，通過RNA干擾技術沉默瓣膜間質細胞中PTX3基因的表達，沉默效率檢測顯示，可有效沉默PTX3。沉默PTX3后，用LPS干預瓣膜間質細胞，Western blot檢測成骨因子表達的變化。實驗結果表明，沉默PTX3后，成骨因子表達明顯減少。因此提示LPS通過上調瓣膜間質細胞中PTX3的表達，進而調節(jié)成骨因子表達，促使瓣膜間質細胞向成骨樣表型轉化，以此參與鈣化性主動脈瓣膜病的發(fā)病機制。該研究表明，LPS誘導的主動脈瓣膜鈣化可能與PTX3高表達存在相關性，PTX3可能促進了主動脈瓣膜的鈣化。該研究為未來尋找新的藥物預防及治療該疾病提供了新的作用靶點及理論基礎，對減少該疾病的發(fā)病率，提高治愈率有重要意義。但是，LPS如何調節(jié)PTX3的表達及PTX3如何導致瓣膜間質細胞表達成骨因子增多的信號通路還有待進一步研究。

參考文獻

[1]Lloyd-Jones D，Adams R J，Brown T M ，et al.Heart disease and stroke statistics，2010 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation ，2010 ，121(7):e46-e215.

[2]Rajamannan N M，Evans F J，Aikawa E，et al.Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: a review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group.Executive summary: calcific aortic valve disease-2011 update[J].Circulation，2011，124(16):1783-1791.

[3]Miller J D，Weiss R M，Heistad D D，et al.Calcific aortic valve stenosis: methods，models，and mechanisms[J].Circ Res，2011，108(11):1392-1412.

[4]Garlanda C，Bottazzi B，Bastone A，et al.Pentraxins at the crossroads between innate immunity，inflammation，matrix deposition，and female fertility[J].Annu Rev Immunol，2005，23(1):337-366.

[5]Nauta A J，de Haij S，Bottazzi B，et al.Human renal epithelial cells produce the long pentraxin PTX3[J].Kidney Int，2005，67(2):543-553．

[6]Naito Y，Tsujino T，Akahofi H，et al.Increase in tissue and circulating pentraxin3 levels in patients with aortic valve stenosis[J].Am Heart J，2010，160(4):685-691.

[7]陳思，董念國，史嘉瑋，等.主動脈瓣膜間質細胞體外誘導鈣化的實驗研究[J].中國胸心血管外科臨床雜志，2010，17(5):385-389.

[8]Zigelman C Z，Edelstein P M.Aortic valve stenosis[J].Anesthesiol Clin，2009，27(3):519-532.

[9]Nakano K，Nemoto H，Nomura R，et al.Detection of oral bacteria in cardiovascular specimens[J].Oral Microbiol Immunol，2009，24(1):64-68.

[10]Cohen D J，Malave D，Ghidoni J J，et al.Role of oral bacterial flora in calcific aortic stenosis: an animal model[J].Ann Thorac Surg，2004，77(2):537-543.

[11]Zeng Q C，Song R，Ao L H，et al.Notch1 promotes the pro-osteogenic response of human aortic valve interstitial cells via modulation of ERK1/2 and nuclear factor-κB activation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33(7):1580-1590.

[12]Deng X S，Meng X Z，Zeng Q C，et al.Adult aortic valve interstitial cells have greater responses to toll-like receptor 4 stimulation[J].Ann Thorac Surg，2015，99 (1):62-71.

[13]Klouche M，Peri G，Knabbe C，et al.Modified atherogenic liposproteins induce expression of pentraxin3 by human vascular smooth muscle cell[J].Atherosclerosis，2004，175(2):221-228．

[14]Dos Santos C C，Han B，Andrade C F，et a1.DNA microarray analysis of gene expression in alveolar epithelial cells in response to TNFalpha，LPS，and cyclic stretch[J].Physiol Genomics，2004，19(3):331-342．

[15]Norata G D，Marchesi P，Pulakazhi Venu V K，et al.Deficiency of the long pentraxin PTX3 promotes vascular inflammation and atherosclerosis[J].Circulation，2009，120(8): 699-708.

[16]Souza D G，Amaral F A，F(xiàn)agundes C T，et al.The long pentraxin PTX3 is crucial for tissue inflammation after intestinal ischemia and reperfiision in mice[J].Am J Pathol，2009，174(4): 1309-1318.

[17]謝艷萍，輔桓欽，郭慧慧，等.MiR-155對LPS信號通路的調節(jié)及其機制[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2015，44(4):416-418，428.

[18]Matsubara J，Sugiyama S，Nozaki T， et al.Pentraxin 3 is a new inflammatory marker correlated with left ventricular diastolic dysfunction and heart failure with normal ejection fraction[J].J Am Coll Cardiol，2011，57(7): 861-869.

[19]Jenny N S，Arnold A M，Kuller L H，et al.Associations of pentraxin 3 with cardiovascular disease and all-cause death: the cardiovascular health study[J].Arterioscler Thromb Vase Biol，2009，29(4):594-599.

(2015-09-23收稿)

Lipopolysaccharide Participates in the Pathogenesis of Calcific Aortic Valve Disease by Upregulating the Expression of PTX3

Mei Li1#，Wang Yang1，2#，Li Fei1etal

1DepartmentofCardiovascularSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China2DepartmentofCardiovascularSurgery，AnhuiProvincialHospital，Hefei230001，China

AbstractObjectiveTo examine the role of lipopolysaccharide(LPS)in the pathogenesis of calcific aortic valve disease(CAVD)and the possible mechanism involving the expression of long pentraxin PTX3.MethodsAortic valve interstitial cells(AVICs)were culturedinvitro，and treated with different concentrations of LPS(0，50，100，200 ng/mL)for 48 h.Western blot was used to detect the expression of PTX3，bone morphogenetic protein 2(BMP2)and osteopontin(OPN).Seventy-two h after transfection with PTX3 siRNA，PTX3 protein was detected in AVICs by Western blot.AVICs were cultured with PTX3 siRNA for 48 h before addition of LPS(200 ng/mL)，and the levels of BMP2 and OPN were measured by immunoblotting.Results①Treatment with different concentrations of LPS caused an increased expression of PTX3，BMP2 and OPN in AVICs in a dose-dependent manner.There were significant differences in the expression of these proteins between 200 ng/mL LPS group and control group(P<0.01).②PTX3 siRNA transfection markedly decreased the level of PTX3 protein when compared with the control group(P<0.01).③BMP2 and OPN were significantly down-expressed in cells treated with LPS plus PTX3 siRNA when compared with the control group(P<0.05).ConclusionLPS stimulates AVICs to express PTX3，which promotes the expression of BMP2 and OPN.PTX3 is involved in the pathogenesis of CAVD.

Key wordscalcific aortic valve disease；long pentraxin PTX3；lipopolysaccharide

中圖分類號：R542.5

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.001

通訊作者△，Corresponding author，張凱倫，E-mail：prozkl@163.com；蘇偉，E-mail：unionsuwei1998@163.com

*湖北省自然科學基金資助項目(No.2013CFB166)

#同為第一作者

梅黎，女，1989年生，碩士研究生，E-mail：1044127892@qq.com；汪洋，男，1989年生，醫(yī)學碩士，E-mail：Jasonmasterwy@163.com