陳麗妃，徐　帆，黃　慧，趙　昕，鐘海彬，李　敏

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·臨床研究·

原發(fā)性閉角型青光眼血漿同型半胱氨酸水平及其代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測分析

陳麗妃，徐帆，黃慧，趙昕，鐘海彬，李敏

Citation:Chen LF,Xu F, Huang H,etal. Detection and analysis of plasma homocysteine levels and its metabolism related indicators in patients with primary angle-closure glaucoma.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(6):1092-1095

摘要

目的：探討同型半胱氨酸水平及其代謝相關(guān)指標(biāo)與原發(fā)性閉角型青光眼的關(guān)系。

方法：選取150例經(jīng)壓平眼壓計、Humphrey 視野計(HVF)、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)、房角鏡等檢查確診為原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)的患者作為試驗組和同期150例我院體檢中心健康者為正常對照組，抽取空腹外周靜脈血，而后測定血漿中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)濃度、維生素B12及葉酸的濃度，并提取DNA，檢測Hcy代謝途徑中關(guān)鍵酶——亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR) C677T的基因型及基因多態(tài)性。

結(jié)果：試驗組血漿中Hcy的濃度為16.11±1.66μmol/L，正常對照組為15.74±1.52μmol/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.04，P=0.04)。試驗組血漿中維生素B12的濃度為248.09±119.07pg/mL，正常對照組為230.21±142.93pg/mL，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.84，P=0.40)。試驗組血漿中葉酸的濃度為12.02±7.81ng/mL，正常對照組為13.15±6.25ng/mL，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.65,P=0.17)。試驗組MTHFR C677T基因型(CC、CT、TT)分布頻率分別84.7%、4.7%、10.7%，正常對照組分別為94.7%、2.0%、3.3%，兩組基因型分布頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.2，P<0.05)；其中試驗組MTHFR基因TT純合子的分布頻率高于正常對照組；試驗組MTHFR基因T、C等位基因頻率分別為87.0%、13.0%，正常對照組為95.7%、4.3%，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.2，P<0.05)。

結(jié)論：PACG患者血漿中Hcy的濃度及MTHFR基因型TT純合子的分布頻率高于正常對照組，說明高Hcy水平及其代謝相關(guān)因素可能與PACG的發(fā)病與發(fā)展密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；維生素B12；葉酸；MTHFR C677T；原發(fā)性閉角型青光眼

引用：陳麗妃，徐帆，黃慧，等.原發(fā)性閉角型青光眼血漿同型半胱氨酸水平及其代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測分析.國際眼科雜志2016;16(6):1092-1095

0引言

青光眼是世界范圍內(nèi)第一位不可逆致盲性眼病，其病理學(xué)基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，及在此基礎(chǔ)上導(dǎo)致的特征性視神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損害。青光眼視神經(jīng)損害的發(fā)病機制復(fù)雜，目前認為主要有眼壓升高的機械壓迫學(xué)說和血管病變的缺血學(xué)說。視網(wǎng)膜視神經(jīng)血管在高眼壓作用下，其自我調(diào)節(jié)功能會發(fā)生障礙，進而導(dǎo)致視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的缺血。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血清同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平升高會導(dǎo)致血管病變[1]，其與眼部血管病變及青光眼視神經(jīng)損害的發(fā)生和發(fā)展也有一定關(guān)系[2-3]。為此我們對一組原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)患者血漿Hcy水平及參與Hcy代謝的維生素B12和葉酸，以及表達Hcy代謝關(guān)鍵酶——亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenterahydrofolate reductase,MTHFR)的基因多態(tài)性進行檢測，旨在進一步探討PACG患者血漿Hcy水平的變化，以及導(dǎo)致PACG患者血漿Hcy變化的可能機制和意義，現(xiàn)總結(jié)如下。

1對象和方法

1.1對象PACG的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有青光眼性視盤損害和(或)視神經(jīng)纖維層缺損；(2)青光眼性視野缺損；(3)前房角鏡檢查顯示前房角為閉角[4]。本研究中試驗組主要納入標(biāo)準(zhǔn)：房角狹窄或關(guān)閉，無其他繼發(fā)性因素；眼底有典型的青光眼性視乳頭凹陷、萎縮；具有不同程度的青光眼性視野缺損。正常對照組納入標(biāo)準(zhǔn)為：無眼部疾病史(屈光不正、白內(nèi)障或斜視除外)；眼底視盤正常；眼壓小于21mmHg。試驗組及正常對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：研究對象間有親緣關(guān)系；嚴(yán)重影響體內(nèi)血管的疾病，例如血栓、嚴(yán)重腎、肝、胃腸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，高血壓、糖尿病、心臟病，自身免疫性疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；服用維生素或激素或其他已知的影響Hcy濃度的藥物，例如抗抑郁藥、多巴胺類藥物、卡馬西平、苯妥英鈉、貝特類、他汀類藥物、抗菌藥物。本研究遵循ARVO宣言和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。依據(jù)PACG診斷標(biāo)準(zhǔn)及本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，收集2013-12/2015-10在我院經(jīng)Topcon裂隙燈顯微鏡、Topcon檢眼鏡、Nidek SL-20壓平眼壓計、Ocular房角鏡、Zeiss Humphrey視野計(HVF)、Topcon光學(xué)相干斷層掃描儀(optical coherence tomography，OCT)等檢查確診為原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma, PACG)的患者150例作為試驗組，其中男73例，女77例，年齡41～87(平均61±13.53)歲。選取同期來我院體檢中心體檢的健康人150例為正常對照組，其中男74例，女76例，年齡45～86(平均61±9.42)歲。兩組間研究對象的年齡及性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本搜集禁食10h后，在肘正中靜脈抽取空腹靜脈血2mL標(biāo)本3份，并迅速采取抗凝、避光、低溫處理。于30min內(nèi)，送實驗室采用2000r/min離心10min，取上清夜，并于-80℃保存，等待下一步檢測。

1.2.2試驗方法利用循環(huán)酶法測定Hcy濃度，具體檢測方法如下:于清晨空腹抽取靜脈血2mL，置于促凝管中，常溫下離心分離血清，并立即送檢，采用全自動生化分析儀及其配套試劑檢測Hcy。利用化學(xué)發(fā)光免疫方法檢測兩組間葉酸、維生素B12濃度，具體檢查方法如下：在專用拇指管中加入150μL血液樣本，依次加入50μL裂解液和300μL沉淀劑，充分振蕩30s至變色，然后11000r/min離心7min，上清液倒入樣品杯中。肝素抗凝血以3500r/min離心10min，取500μL血漿放入樣品杯中。運行化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，依次加入處理好的樣本，設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)。運行系統(tǒng)，讀取數(shù)據(jù)并記錄。利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)檢測MTHFR基因型，具體檢測方法如下：吸取EDTA抗凝管中外周靜脈血200μL至1.5mL離心管中，加入20μL Proteinase K,混勻。加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃水浴箱中放置10min,期間顛倒數(shù)次，溶液變清亮。加入200μL無水乙醇，充分顛倒混勻。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，13400g離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，13400g離心30s，倒掉收集管中的廢液。向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g離心30s，倒掉收集管中廢液。重復(fù)操作步驟6次。13400g離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3至于室溫放置數(shù)10min，以徹底晾干吸附柱材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加100μL洗脫緩沖液TB，室溫放置15min，13400g離心2min，將溶液收集到離心管中。所得DNA產(chǎn)物保存在-20℃?；蚪MDNA濃度測定。吸取2μL DNA樣本，加入到198μL滅菌去離子水中，紫外分光光度計測量儀讀取數(shù)值，重復(fù)測量，取平均值。應(yīng)用PCR儀擴增大小約146bp的DNA片段。瓊脂糖電泳，應(yīng)用2.0%瓊脂糖凝膠水平電泳檢測PCR產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳條帶及Marker(MD101)相比位置是否正確和是否有非特異擴增。Hinf I酶酶切反應(yīng)體系在最適溫度37℃下水浴2h。取5μL酶切產(chǎn)物加0.5μL 6×Loading buffer上樣緩沖液混勻后上樣，電泳緩沖液為新配制的(0.5×TBE)：使用時加雙蒸水稀釋(5×TBE)緩沖液，室溫下恒壓120V電流320mA電泳30min。血漿中總Hcy濃度參考值為5.90～16.00μmol/L，葉酸正常范圍參考值為2.00～16.00ng/mL，維生素B12正常范圍參考值為191.00～663.00pg/mL。

1.2.3觀察指標(biāo)記錄試驗組及正常對照組的血漿中總Hcy、維生素B12及葉酸的濃度，MTHFR C677T的基因型。測量的方法、標(biāo)準(zhǔn)、人員一致，以免出現(xiàn)測量偏倚。

2結(jié)果

2.1兩組血漿中總Hcy和維生素B12及葉酸的濃度試驗組血漿中Hcy的濃度為16.11±1.66μmol/L，正常對照組為15.74±1.52μmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.04，P=0.04)。試驗組血漿中維生素B12的濃度為248.09±119.07pg/mL，正常對照組為230.21±142.93pg/mL，兩組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.84，P=0.40)。試驗組血漿中葉酸的濃度為12.02±7.81ng/mL，正常對照組為13.15±6.25ng/mL，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.65,P=0.17)。

2.2兩組MTHFR基因C677T多態(tài)性電泳結(jié)果MTHFR基因C677T經(jīng)內(nèi)切酶HinfⅠ消化及瓊脂糖凝膠電泳后，呈現(xiàn)三種基因型，分別為純合子野生型C/C、雜合子型C/T、純合子野生型T/T。MTHFR基因C677T C/C、C/T和T/T基因型分布頻率在試驗組分別為84.7%(127/150)，4.7%(7/150)，10.7%(16/150)，正常對照組分別為94.7%(142/150)，2.0%(3/150)，3.3%(5/150)，兩組之間的基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.2，P<0.05)；MTHFR基因C677T C等位基因與T等位基因分布頻率在試驗組分別為87.0%(267/300)、13.0%(39/300)，正常對照組分別為95.7%(287/300)、4.3%(13/300)，兩組之間的等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.2，P<0.05)。

3討論

青光眼的發(fā)病與多種因素有關(guān)，比如房角解剖結(jié)構(gòu)、年齡、性別、環(huán)境、基因遺傳[5]。原發(fā)性青光眼根據(jù)房角解剖形態(tài)分為原發(fā)性閉角型青光眼和原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)，其中PACG是中國主要的青光眼類型[6]。我國PACG患病率高，預(yù)計至2020年患者將達到1 009萬，約占世界PACG患者總數(shù)的48%[7]，這一數(shù)據(jù)沖擊迫使我們把PACG作為我國重要的公共衛(wèi)生問題。

青光眼視神經(jīng)損傷的發(fā)病機制尚未完全明了。目前，青光眼的發(fā)病機制主要有兩種學(xué)說，一種是機械學(xué)說，另一種是血管缺血學(xué)說。機械學(xué)說是一種比較公認的青光眼發(fā)病機制，強調(diào)的是高眼壓對視神經(jīng)的損害。近年來，越來越多的學(xué)者將研究方向轉(zhuǎn)向了血管缺血學(xué)說，血管缺血學(xué)說中強調(diào)的是視網(wǎng)膜視神經(jīng)血管調(diào)節(jié)障礙和相關(guān)代謝對視神經(jīng)纖維的影響，降低視神經(jīng)纖維及視神經(jīng)對眼壓的耐受力[8]。

大量研究表明，Hcy是公認的心腦血管疾病重要的危險因素之一[1]。此外，Hcy也是視網(wǎng)膜血管疾病的一個危險因素，比如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和視網(wǎng)膜中央動脈阻塞[2]；并且，環(huán)境和基因因素可引起血漿中Hcy濃度的改變。Hcy水平是否與原發(fā)性開角型青光眼的發(fā)病有關(guān)仍然存在爭議，Johannes等的研究表明，Hcy的水平在原發(fā)性開角型青光眼患者的血漿中是升高的[9]；Laura等的研究表明Hcy與剝脫性青光眼(pseudoexfoliative glaucoma,PXG)的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，在PXG患者中，血漿Hcy水平升高；但是在原發(fā)性開角型青光眼和正常人中，血漿Hcy水平未見明顯升高[10]。在本研究中，原發(fā)性閉角型青光眼的Hcy濃度為16.11±1.66μmol/L，正常對照組為15.74±1.52μmol/L，兩組的差異較小，但差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.04，P=0.04)。Hcy是可以反應(yīng)視神經(jīng)受損的敏感指標(biāo)之一[11]，Hcy可以直接對青光眼患者的視神經(jīng)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害作用，亦可通過對營養(yǎng)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)血管產(chǎn)生的影響，間接和青光眼性視神經(jīng)損害發(fā)生關(guān)系?；诒敬窝芯拷Y(jié)果，在原發(fā)性閉角型青光眼中，除了高眼壓對視神經(jīng)有損害之外，Hcy的高水平在其發(fā)病及發(fā)展中可能是一個危害因素。

作為輔助因子的B族維生素(葉酸、維生素B12、維生素B6)是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵因素。因我院未能行維生素B6的測定，故只測定葉酸及維生素B12的濃度。既往的研究表明，B族維生素的水平在各種類型的青光眼中是不一樣的。Tongabay等的研究表明，維生素B12的濃度在剝脫性青光眼患者、原發(fā)性開角型青光眼患者、正常眼壓性青光眼患者以及正常人血漿中的差異是無統(tǒng)計學(xué)意義的；葉酸的濃度在剝脫性青光眼患者血漿中較正常人是明顯降低的，而在原發(fā)性開角型青光眼患者、正常眼壓性青光眼患者中的濃度與正常人的相比，濃度相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[12]。本課題研究的結(jié)果表明，維生素B12、葉酸雖然是Hcy代謝組的關(guān)鍵輔助因子，但是它們的水平差異在原發(fā)性閉角型青光眼患者和正常人中沒有意義，說明Hcy的水平不受維生素B12和葉酸濃度的影響。

MTHFR是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它催化從5，10-亞甲基四氫葉酸到5-甲基四氫葉酸的還原反應(yīng)。C677TC-T突變是MTHFR基因中最常見的基因突變，不同的基因型可能會影響MTHFR的活性。宗永華等[13]在對241例的原發(fā)性高血壓患者進行Hcy與C677T基因多態(tài)性關(guān)系的探索中發(fā)現(xiàn)，C677T基因多態(tài)性與Hcy和高血壓關(guān)系密切，其中 C677T的純合突變可能是Hcy升高和H型高血壓重要遺傳因素。Shazia等研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性閉角型青光眼患者中，C677T的多態(tài)性會降低MTHFR的酶活性，從而導(dǎo)致血漿中Hcy水平的升高[14]。在本研究中，MTHFR基因C677T C/C、C/T和T/T基因型分布頻率在試驗組分別為84.7%、4.7%、10.7%，正常對照組分別為94.7%、2.0%、3.3%，兩組之間的基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.2，P<0.05)；MTHFR基因C677T C等位基因與T等位基因在實驗組的分布頻率分別為87.0%、13.0%，在正常對照組中分別為95.7%和4.3%，兩組之間的等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.2，P<0.05)。結(jié)果說明了C677T的多態(tài)性會降低MTHFR的酶活性，致使血漿中Hcy水平的升高，從而導(dǎo)致PACG易感。研究結(jié)果與Micheal等的研究結(jié)果一致。

在本研究中，充分說明了Hcy水平及其代謝相關(guān)指標(biāo)與原發(fā)性閉角型青光眼相關(guān)，其中，Hcy水平的升高和C677T的基因多態(tài)性與原發(fā)性閉角型青光眼的發(fā)病發(fā)展密切相關(guān)，高Hcy水平可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡及氧化損傷，是原發(fā)性閉角型青光眼的危險因素之一。這提示我們，在控制青光眼的同時積極預(yù)防和治療高Hcy血癥是有效控制青光眼高發(fā)的重要措施。

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Detection and analysis of plasma homocysteine levels and its metabolism related indicators in patients with primary angle-closure glaucoma

Li-Fei Chen, Fan Xu, Hui Huang, Xin Zhao, Hai-Bin Zhong, Min Li

Foundation item:Guangxi Natural Science Foundation (No. 2012GXNST-AA276039)

Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region，China

Correspondence to:Min Li. Department of Ophthalmology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region，China.limin00899@163.com

Received：2016-01-05Accepted：2016-05-05

Abstract

?AIM: To explore the relation of homocysteine (Hcy) and its metabolic related indicators with primary angle-closure glaucoma (PACG).

?METHODS: In this study, a total of 150 PACG patients and 150 controls were enrolled. The patients with PACG were diagnosed by applanation tonometer, Humphrey perimetry (HVF), optical coherence tomography(OCT), gonioscope. The normal controls were recruited from physical examination center. Blood samples were collected and the plasma was used to determine homocysteine, vitamin B12 and folic acid. DNA was extracted to determine the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677TT genotype and gene polymorphism.

?RESULTS: There was a statistically significant difference(t=2.04，P=0.04) in mean homocysteine levels between patients with PACG(16.11±1.66μmol/L) and controls(15.74±1.52μmol/L). The level of vitamin B12 in PACG group was 248.09±119.07pg/mL and the control group was 230.21±142.93pg/mL. No statistically significant difference was found on the vitamin B12 level between the two groups (t=0.84，P=0.40). The folic acid levels showed no statistically significant differences(t=1.65,P=0.17) between the PACG group(12.02±7.81ng/mL) and the control group(13.15±6.25ng/mL). The frequency distribution of the MTHFR C677T genotypes was found to be significantly associated (χ2=6.2，P<0.05) with PCAG (CC 84.7%, CT 4.7%, TT 10.7%) as compared to the controls (CC 94.7%, CT 2.0%, TT 3.3%). The frequency distribution of TT genotypes of MTHFR C677T in the PACG group was significantly higher than that in the control group. Moreover, our findings showed significant difference (χ2=14.2，P<0.05) between the allele frequency of the C677T single nucleotide polymorphism within the MTHFR gene in POAG patients(T 87.0%, C 13.0%) and the control group(T 95.7%,C 4.3%) .

?CONCLUSION: These results show that the Hcy level and the TT genotypes of MTHFR C677T were higher in the PACG patients than in controls. Therefore, our data suggests that high Hcy level and the related indicators are associated with high PACG risk.

KEYWORDS:?homocysteine; vitamin B12; folic acid; MTHFR C677T; primary angle-closure glaucoma

基金項目：廣西自然科學(xué)基金項目(No.2012GXNST-AA276039)
作者單位：(530021)中國廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院眼科

作者簡介：陳麗妃，女，畢業(yè)于廣西醫(yī)科大學(xué)，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：青光眼、眼底疾病。

通訊作者：李敏，女，畢業(yè)于廣州中山醫(yī)科大學(xué)，碩士，主任醫(yī)師，眼科科主任，研究方向：青光眼、眼底疾病.limin00899@163.com

收稿日期：2016-01-05 修回日期： 2016-05-05

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.6.22