閔　彥，王　燕，胡成進(jìn)

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ANCA相關(guān)性血管炎的實(shí)驗(yàn)室診斷及研究進(jìn)展

閔彥，王燕，胡成進(jìn)

［關(guān)鍵詞］ANCA相關(guān)性血管炎;蛋白酶3;髓過(guò)氧化物酶;實(shí)驗(yàn)室診斷

［作者單位］250031濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科

1　血管炎的分類

血管炎是一組異質(zhì)性疾病，均以血管壁炎癥為主要表現(xiàn)。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)的系統(tǒng)性血管炎至少有20種。血管炎首先按受累血管的大小進(jìn)行分類，包括小血管(毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈)、中等血管(肌性動(dòng)脈和小動(dòng)脈)和大血管(主動(dòng)脈及其主要分支)。韋格納肉芽腫(肉芽腫性多血管炎)(GPA)、顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)及Churg-Strauss綜合征(嗜酸細(xì)胞肉芽腫性多血管炎) (EGPA)是一組累及小至中等血管并具有一些相同臨床、病理和實(shí)驗(yàn)室特征的血管炎?？怪行粤＜?xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)是診斷以上3種小血管炎的有效工具［1］。

2　ANCA相關(guān)性血管炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

ANCA的靶抗原有10余種，與臨床最相關(guān)的是蛋白酶3 (PR3)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)，兩者與ANCA相關(guān)血管炎及這些疾病的腎臟表現(xiàn)密切相關(guān)［2］。2012年CHCC命名會(huì)議認(rèn)為，臨床上對(duì)血管炎患者分類，需要包括抗原的特異性以及血管炎的臨床病理表型，比如說(shuō)，是PR3-MPA，還是MPO-MPA［3］。間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)聯(lián)合應(yīng)用是檢測(cè)ANCA相關(guān)血管炎的最佳方法。對(duì)臨床疑診為ANCA相關(guān)性血管炎的患者建議進(jìn)行ANCA測(cè)定，并針對(duì)抗PR3抗MPO特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)［2］。

用IIF檢測(cè)乙醇固定的中性粒細(xì)胞共有3種熒光模型。(1)c-ANCA，是彌散的胞漿熒光顆粒，在90%活動(dòng)性的GPA中陽(yáng)性。其靶抗原主要是PR3。其他靶抗原包括殺菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)等。(2)p-ANCA，是一種中性粒細(xì)胞核周的染色，主要見(jiàn)于MPA和EGPA。其靶抗原主要是MPO。其他靶抗原包括乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)、溶酶體(lysozyme，LYS)、組織蛋白酶G(cathepsin G，Cath G)、BPI等。(3)非典型ANCA，即AANCA。A-ANCA比較少見(jiàn)，主要是同時(shí)胞漿染色和核周染色，或者是細(xì)胞核染色，具有多種抗原的特異性。A-ANCA主要和藥物暴露、關(guān)節(jié)炎或者類風(fēng)濕病相關(guān)，很少見(jiàn)于血管炎。其靶抗原目前尚不清楚，LF、LYS、BPI都有報(bào)道，但無(wú)統(tǒng)一結(jié)論［4-5］。

用乙醇固定的中性粒細(xì)胞檢測(cè)ANCA易受到抗核抗體的干擾，用甲醛固定的中性粒細(xì)胞檢測(cè)ANCA可以排除這種干擾。Lin等［6］研究表明，中性粒細(xì)胞的雙基質(zhì)片(用乙醇和甲醛分別固定中性粒細(xì)胞)可以更好的辨別標(biāo)本是否是ANCA陽(yáng)性。中性粒細(xì)胞的雙基質(zhì)固定是用IIF檢測(cè)ANCA的重要策略之一。

抗MPO抗體陽(yáng)性強(qiáng)烈提示壞死性血管炎或特發(fā)性新月體型腎小球腎炎(NCGN)。64%的壞死性NCGN患者可檢測(cè)出抗MPO抗體，MPA患者陽(yáng)性率為60%，EGPA患者陽(yáng)性率為50%，GPA患者陽(yáng)性率為24%。除EGPA病例外，上述病例的大部分MPO陰性患者都可檢出抗PR3抗體陽(yáng)性。MPO-ANCA在10%～15%的SLE中存在，可能與慢性炎癥有關(guān)，如動(dòng)脈炎、漿膜炎和C-反應(yīng)蛋白增高?？筆R3抗體在臨床上與GPA密切相關(guān)。敏感性取決于疾病的活動(dòng)性和病期階段，在初發(fā)不活動(dòng)的GPA中，陽(yáng)性率只有50%，而在活動(dòng)性典型性GPA中，幾乎100%陽(yáng)性。PR3-ANCA在其他原發(fā)性血管炎中也可被檢測(cè)到，如MPA、NCGN等［7］。

除了系統(tǒng)性血管炎外，ANCA在炎癥性腸病和自身免疫性肝病的診斷和鑒別診斷過(guò)程中也具有重要意義［7］。pANCA與炎性腸病(IBD)相關(guān)。IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩(Crohn disease，CD)2種疾病。pANCA在UC患者血清中陽(yáng)性率為60%～80%，而在CD患者中陽(yáng)性率為10%～20%［5］。此外，ANCA在原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)的陽(yáng)性率為60%～80%，在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的陽(yáng)性率為30%，ANCA還與自身免疫性肝炎(AIH)相關(guān)。

3　ANCA相關(guān)性血管炎檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

3．1間接免疫熒光法的成像分析系統(tǒng)雖然有很多可替代的篩查方法出現(xiàn)，對(duì)于用ANCA篩查血管炎，IIF仍然是推薦的方法。但是，這種方法的可信性取決于很多因素，包括底物、酶及閱片人的經(jīng)驗(yàn)等。為了解決這些問(wèn)題，以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的間接免疫熒光法的成像分析系統(tǒng)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于ANCA的檢測(cè)。ANCA的IIF成像分析系統(tǒng)有很多優(yōu)勢(shì):如節(jié)約標(biāo)本和試劑，縮短檢測(cè)時(shí)間等。有些檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)商業(yè)化，它們可以檢測(cè)有無(wú)ANCA的存在，并且可能區(qū)分特別的熒光模式。

AKLIDES(Medipan GmbH，Germany)是一種IIF成像分析系統(tǒng)。這種系統(tǒng)可以分析熒光的強(qiáng)度，并且在結(jié)合乙醇染色和甲醛染色的基礎(chǔ)上，分析基本的ANCA模型。Knutter等［8］研究表明，這種自動(dòng)熒光分析系統(tǒng)與人工分析相比，在區(qū)分是否是ANCA方面高度一致，在結(jié)合乙醇和甲醛染色的基礎(chǔ)上，可以較好的判斷熒光模型。但是，在判讀胞漿和非典型ANCA時(shí)，這種自動(dòng)判讀系統(tǒng)的敏感性，不及人工［8］。Damoiseaux小組［9］研究也表明，自動(dòng)判讀系統(tǒng)識(shí)別PR3-ANCA陽(yáng)性(乙醇固定)的AAV時(shí)，敏感性較人工低。但它對(duì)甲醛染色C-ANCA識(shí)別較好。對(duì)于MPO-ANCA陽(yáng)性的血清，自動(dòng)判讀系統(tǒng)對(duì)乙醇固定中性粒細(xì)胞的P-ANCA識(shí)別較好，但對(duì)甲醛固定中性粒細(xì)胞的C-ANCA模型識(shí)別較差。與人工相比，在ANA存在的情況下，這種自動(dòng)分析系統(tǒng)區(qū)分AANCA及P-ANCA比較困難［9］。因?yàn)锳NCA的熒光模型預(yù)示著ANCA抗原的特異性，因此，自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)需要在識(shí)別乙醇固定中性粒細(xì)胞熒光模型方面優(yōu)化［4］。

CytoBead技術(shù)是一種結(jié)合細(xì)胞和磁珠的數(shù)字化IIF分析技術(shù)，可同時(shí)進(jìn)行ANCA初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。Sowa等人研究表明，CytoBead技術(shù)所確認(rèn)的PR3-ANCA，MPO-ANCA，P-ANCA，C-ANCA，與經(jīng)典的ANCA分析法具有一致性，兩者沒(méi)有明顯的差異。CytoBead技術(shù)具有多重分析功能，可同時(shí)進(jìn)行初篩以及確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，是一種使用自動(dòng)數(shù)字化IIF的快速有效的ANCA分析技術(shù)［10］。間接免疫熒光法的自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)對(duì)于ANCA的篩查是一個(gè)具有前景的技術(shù)。但是，在臨床應(yīng)用之前，還需要進(jìn)一步的改進(jìn)和多中心對(duì)它的評(píng)估。

3．2特異性抗原的免疫測(cè)試傳統(tǒng)的直接ELISA是將抗原直接包被在固體板上，而捕獲式ELISA及錨定式ELISA都將抗原固定在單克隆抗體或“橋分子”上?？乖禺愋缘牟东@式ELISA可用來(lái)檢測(cè)PR3-ANCA和MPO-ANCA。錨定式ELISA主要是檢測(cè)PR3-ANCA。捕獲式ELISA或錨定式ELISA法與IIF相結(jié)合，可最大程度提高AAV患者血清的檢測(cè)敏感性。因?yàn)榭乖禺愋缘牟东@式ELISA和錨定式ELISA檢測(cè)PR3-ANCA與MPO-ANCA具有更好的可操作性，所以，很多學(xué)者對(duì)目前ANCA相關(guān)血管炎的實(shí)驗(yàn)室診斷流程發(fā)出質(zhì)疑，建議先以ELISA作為第一步的初篩實(shí)驗(yàn)，再以IIF進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)［4］。在稍早些的研究中，Russell［11］就提出了類似的建議。Russell等在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)條件下，比較了標(biāo)準(zhǔn)化IIF、MPO直接ELISA以及PR3捕獲式ELISA的檢測(cè)效率。結(jié)果表明，PR3-ANCA以及MPO-ANCA聯(lián)合檢測(cè)具有最好的敏感性，用IIF檢測(cè)的C-ANCA具有最好的特異性。Russell提出，為了保持最大的診斷準(zhǔn)確性，并節(jié)約人工勞動(dòng)，可以先用ELISA進(jìn)行初篩，再用IIF進(jìn)行確認(rèn)。這種新的流程有待于多中心的聯(lián)合驗(yàn)證，以確認(rèn)是否是一種具有更好敏感性和特異性的檢測(cè)方法［12］。

3．3其他的免疫學(xué)檢測(cè)方法包括免疫印跡法、側(cè)向?qū)游龇?、基于流式?xì)胞術(shù)的磁珠法及電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。De Joode等人研究表明，印跡法與ELISA一樣，可迅速檢測(cè)ANCA和抗腎小球基底膜抗體，有利于提高血管炎患者的檢出率，是有力的快速診斷工具［13］。Damoiseaux等［14］研究發(fā)現(xiàn)Europlus ANCA Biochip(印跡法膜條)對(duì)ANCA相關(guān)血管炎的診斷敏感性和特異性，與IIF及ELISA法的聯(lián)合應(yīng)用具有一致性。免疫印跡法屬于定性測(cè)定，結(jié)果最終還需用ELISA法的定量測(cè)定。Offermann小組［15］證實(shí)了側(cè)向?qū)游龇z測(cè)PR3及MPO的抗體，與ELISA法的檢測(cè)結(jié)果，有很好的一致性。側(cè)向?qū)游龇ǖ膬?yōu)點(diǎn)在于經(jīng)濟(jì)，特別有利于早期和準(zhǔn)確診斷。而基于流式細(xì)胞術(shù)的磁珠法測(cè)定特異性不及聯(lián)合應(yīng)用IIF和ELISA法，敏感性與IIF類似，比ELISA法敏感性更強(qiáng)一些，特異性與ELISA法類似［16］。此外，電化學(xué)發(fā)光法也用于檢測(cè)PR3和MPO兩種抗體。Mahler等［17-18］進(jìn)行的一項(xiàng)大型多中心的研究表明，電化學(xué)檢測(cè)法具有更好的動(dòng)力學(xué)范圍，更完整的線性稀釋曲線及更好的批間和批內(nèi)精密度。與現(xiàn)有的ELISA試劑盒相比，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PR3和MPO抗體的敏感性和特異性具有一致性。

4　ANCA對(duì)臨床診斷的意義

ANCA檢測(cè)只是臨床診斷的輔助手段，必須結(jié)合患者的病史、影像學(xué)及臨床癥狀來(lái)診斷，血管炎的組織學(xué)檢測(cè)是金標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)待檢患者都需要做這方面的檢測(cè)［4］。ANCA在監(jiān)測(cè)疾病活動(dòng)性、指導(dǎo)對(duì)AAV患者的處理方面的作用，仍然是有爭(zhēng)議的。北京協(xié)和醫(yī)院診療常規(guī)認(rèn)為，PR3-ANCA抗體滴度與病情活動(dòng)一致，在GPA等原發(fā)性血管炎患者，常被作為判斷療效、估計(jì)復(fù)發(fā)的指標(biāo)，從而指導(dǎo)臨床治療。但Tomasson等［19］所做的meta分析表明，ANCA在監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)方面的作用很有限。在隨訪的AAV患者中，ANCA滴度的上升，并不伴隨著病情的復(fù)發(fā)。醫(yī)生可能更傾向于通過(guò)尿常規(guī)來(lái)監(jiān)測(cè)病情的復(fù)發(fā)。通過(guò)捕獲式或錨定式ELISA檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)AAV的復(fù)發(fā)，還需更好地研究才能應(yīng)用于臨床［5，19］。

總之ANCA相關(guān)性血管炎的實(shí)驗(yàn)室診斷具有重要的作用，但必須結(jié)合患者的病史加以分析，才能更好的服務(wù)于臨床診斷和治療。新發(fā)展的ANCA診斷技術(shù)，包括以計(jì)算機(jī)成像技術(shù)為基礎(chǔ)的IIF識(shí)別系統(tǒng)，錨定式或捕獲式的ELISA，都具有較好的發(fā)展前景。以計(jì)算機(jī)成像技術(shù)為基礎(chǔ)的IIF識(shí)別系統(tǒng)有可能在將來(lái)取代人工閱片。但最終的ANCA檢測(cè)報(bào)告，還需要有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行確認(rèn)。錨定式或捕獲式的ELISA有可能取代IIF成為一種ANCA的初篩方法?？焖贆z測(cè)PR3和MPO抗體的檢測(cè)方法包括印跡法、電化學(xué)發(fā)光法等，有利于快速診斷復(fù)發(fā)的血管炎患者并對(duì)其進(jìn)行處理，以防止疾病的惡化和腎衰的出現(xiàn)。

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(本文編輯:林永麗)

(收稿日期:2015－06－06)

［中圖分類號(hào)］R34

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A［DOI］10．3969/j．issn．1009－0754．2016．01．037