李　強，趙澤慧，牛耀祖，許立華

(寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750001)

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文獻綜述

牛支原體膜蛋白研究進展

李強，趙澤慧，牛耀祖，許立華*

(寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750001)

摘要：膜蛋白是牛支原體的重要結構，在牛支原體與宿主間的互作中具有重要作用。近年來，據(jù)報道牛支原體可變表面脂蛋白在病原黏附力及致病性中具有重要作用。論文主要綜述了牛支原體膜蛋白和可變表面脂蛋白的研究進展，并介紹了牛支原體的黏附力以及其膜蛋白在牛支原體檢測上的應用，以期為今后牛支原體膜蛋白的研究、疫苗和檢測試劑盒的研發(fā)提供參考。

關鍵詞：牛支原體；膜蛋白；黏附力

1961年，由Hale等在美國一例患嚴重乳房炎的奶牛中首次分離到牛支原體(Mycoplasmabovis)。在柔膜體綱下的不同分類學中，目前已認定超過100種支原體，至少20種能感染牛。其中，牛支原體是最重要的一種。在全球范圍，牛支原體是造成肉牛、奶牛、犢牛一系列病癥的重要病原體。牛支原體感染可引起肺炎、關節(jié)炎、乳房炎、角膜結膜炎、中耳炎和生殖障礙等相關疾病，引起不可估量的經(jīng)濟損失[1]。

在我國，由辛九慶等人從犢牛肺臟中首次分離得到牛支原體，隨后在國內(nèi)多個省市均發(fā)現(xiàn)牛支原體感染病例[2]。隨著該病的流行，牛支原體越來越受到重視，與之相關的研究日益增多。本文主要對牛支原體膜蛋白及其可變表面脂蛋白的研究進展進行綜述，以期為今后牛支原體膜蛋白的研究提供參考。

1牛支原體膜蛋白

牛支原體結構相對簡單，沒有細胞壁，其表面聚集著大量脂蛋白，因此膜蛋白在牛支原體功能中有著重要作用，同時也是利用其作為研究膜結構和功能模型的主要原因。然而牛支原體膜蛋白與宿主之間有著復雜的相互作用關系。其細胞膜上含有的主要抗原物質(zhì)是膜蛋白和糖脂，能夠刺激宿主產(chǎn)生相應的體液免疫和細胞免疫應答[3]。目前除可變表面膜蛋白，僅有很少的牛支原體膜蛋白被鑒定。研究結果顯示，一種48 ku的牛支原體膜脂蛋白p48，與發(fā)酵支原體的巨噬細胞極化脂蛋白(macrophage activating lipoprotein, MALP)具有同源性。由于牛支原體的結構和抗原的保守性，可作為感染的血清學標記。另一種68 ku的旁系同源編碼的假定蛋白p68，已在牛支原體PG45克隆變異體6中被認定。p68蛋白的基因只在某些牛支原體中檢測到，而這些牛支原體同時包含p48基因。因此，在所有支原體中，僅有牛支原體含有MALP的多種同系物。由于牛支原體與無乳支原體等具有較高的同源性，急需特異性蛋白用于區(qū)分和檢測。目前，通過對部分牛支原體基因組測序，多數(shù)膜蛋白是由基因組序列假定預測的。因此，還有許多牛支原體膜蛋白和假定蛋白需要研究和鑒定。

2牛支原體可變表面脂蛋白

牛支原體細胞質(zhì)膜含有獨特的膽固醇，總蛋白含量高達50%以上。這些膜和膜相關蛋白十分重要，通常含有細胞黏附素。同細胞質(zhì)膜相關的其他蛋白大多為脂蛋白，通常暴露在外環(huán)境中，通過酰基附著于細胞質(zhì)膜上[4]。

牛支原體基因組的靈活性，使其具有高度可變的表面抗原，這是造成慢性感染的重要因素。PG45型菌株由13個不同的單拷貝可變表面脂蛋白(variable surface protein, Vsp)基因組成的染色體群，即Vsp基因座。該基因座大約23 kb，包含2個閱讀框(open reading frame, ORF)，有較高的同源性。Vsp基因座具有雙親特性，含有脂肪酸和半胱氨酸殘基[5]。Vsp基因包含保守的5′端非編碼序列，分為兩個基因盒，基因盒Ⅰ與全Vsp基因有99%的同源性，具有編碼指定的核糖體結合位點[6]?；蚝孝蛱幱诨蚝孝竦纳嫌危哂懈叩目勺冃?。該序列跟隨在一個開放閱讀框之后，N末端區(qū)域與98%～99%的菌株具有一致性，包裹著載脂蛋白信號肽。而Vsp的C末端結構域，表面暴露[7]。由于Vsp基因具有高度的變異性，導致牛支原體在面對來自宿主的不同選擇壓力時，不斷增強變異性，提高生存能力。

Sachse K等[8]已發(fā)現(xiàn)牛支原體可變表面脂蛋白能自發(fā)進行高頻相位變化。On與Off之間表達狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，是由于牛支原體染色體上DNA特殊位點的重排，根據(jù)高度同源性相位變化的機制還發(fā)現(xiàn)，與無乳支原體具有密切相關性。Vsp在牛支原體感染機制中有著重要作用，其變異表達和復雜結構共同決定了它的功能，可做為感染的血清學標記。同時Vsp的變異性又導致了宿主的特異性和牛支原體的慢性疾病。但是，目前的困難在于明確其復雜的結構和高度的可變性。

3牛支原體的黏附力

黏附是牛支原體侵染的第一步，因此黏附素的表達十分關鍵。由于基因組很小和缺少必要的生物合成途徑，牛支原體先黏附宿主細胞，進行細胞膜的融合，然后相互交換細胞膜和細胞內(nèi)成分。然而，在牛支原體中并未發(fā)現(xiàn)能夠積累大量黏附素的極性結構。通常認為牛支原體黏附素幾乎覆蓋整個膜蛋白的表面[9]。此外，在細胞黏附實驗中，添加純化的Vsp可減少牛支原體的細胞黏附因子，并且Vsp將留存于宿主的細胞層中。Vsp通過重復域中的寡肽抑制牛支原體局部的細胞黏附因子[10]。表面抗原的變異，通過刪除或嵌入Vsp的重復單元，去除或產(chǎn)生一些額外的抗原表位，導致細胞黏附因子的增減以及更寬或更窄范圍的配體結合[11]。目前，通過研究已知牛支原體的黏附力與膜蛋白和可變脂蛋白有著密切聯(lián)系，但是對于黏附素的分泌和牛支原體與宿主細胞黏附作用的機制還需進一步研究。

4牛支原體膜蛋白在檢測上的應用

近年來，國內(nèi)外牛支原體病的檢測方法主要集中在病原體的分離鑒定、血清學檢測、基因診斷三個方面[12]。傳統(tǒng)的檢測方法主要通過病原的分離鑒定判斷牛支原體感染，但由于在臨床實踐中，牛支原體的分離經(jīng)常受到其他病原菌或者抗菌藥物的影響，分離較為困難并且對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)周期長，無法對牛支原體感染進行快速檢測。PCR技術可廣泛的應用于檢測，但是需要對樣品進行較為復雜的處理，對實驗室的條件和儀器設備有一定的要求，同時需要一定的專業(yè)人員進行操作，不適用于基層和臨床工作的廣泛應用[13]。與這些檢測方法相比，血清學檢測具有方便、快捷、敏感性強等特點。其中ELISA方法、間接血凝試驗(IHA)等廣泛應用于實踐當中，并且適用于大量樣本的檢測。1981年一種全菌蛋白的間接ELISA方法用于檢測牛支原體抗體[14]，當然特定的目標蛋白比全菌蛋白具有更高的特異性。目前，一些牛支原體膜蛋白和脂蛋白已發(fā)展應用于牛支原體的檢測和分析。

4.1牛支原體p48蛋白

該蛋白是一種48 ku的牛支原體膜脂蛋白。簡瑩娜等[15]優(yōu)化并合成了牛支原體的p48基因，將其克隆到pET-32a表達載體上，16℃低溫誘導表達，獲得可溶性重組p48蛋白。將純化后的重組p48蛋白與靴酸處理過的綿羊紅細胞，建立了檢測牛支原體抗體的間接血凝試驗，牛支原體超免血清抗體效價達1∶2 048～1∶4 096。該方法同多種其他病原菌的陽性血清檢測結果均為陰性。與國外商品化的牛支原體ELISA試劑盒相比，平均符合率為96.15%。該方法敏感性高、特異性強、重復性好，可用于牛支原體抗體水平檢測及流行病學的調(diào)查[16]。

4.2牛支原體pMB67蛋白

Behrens等于PG45中鑒定了一種新膜蛋白——pMB67，是牛支原體感染的主要抗原。該蛋白是一種在Vsp上具有重要功能的可變抗原成分，但是與Vsp沒有抗原性和結構上的相似性，不是Vsp家族成員[17]。pMB67位于菌體表面，是特異性單克隆抗體的特定抗原表位，與Vsp相比不包含多個重復亞單位，但與Vsp結合后能獨立表達，提高了合成能力，并能保持原有的結構性、抗原性和表面功能[18]。同時重組Vsp也表現(xiàn)出較高的免疫活性。現(xiàn)已證明Vsp和pMB67能表現(xiàn)出多樣化的表達模式，并且感染牛支原體時具有高度可變性[19]。因此，可以以混合重組型抗原為基礎，建立一套靈敏的免疫分析系統(tǒng)，用于牛支原體感染的特異性快速檢測，具有較好的發(fā)展前景。

4.3牛支原體p26蛋白

p26抗原開發(fā)的一種單克隆抗體已建立一種抗原捕獲ELISA方法，能檢測出牛乳樣中的支原體。雖然p26單克隆抗體與無乳支原體有交叉反應，但只要無乳支原體不出現(xiàn)在牛奶中，并不影響牛支原體乳房炎的檢測。在胚胎牛肺細胞(embryonic lung cells, EBL)中，p26蛋白對牛支原體的黏附力起重要作用[20]，p26基因的表達水平與不同菌株黏附力的相對水平相關，而單克隆抗體p26對黏附素有抑制作用。通過單克隆抗體的制備，能夠有效、迅速、準確的抑制黏附作用，從而阻斷牛支原體對宿主細胞的侵染。

4.4牛支原體的α化酶

牛支原體的α化酶已被證明是一種表面暴露蛋白，能通過結合纖維蛋白溶酶原黏附EBL細胞。它能作為一種纖維蛋白溶酶原的受體，有助于牛支原體在宿主體內(nèi)的侵染和擴散。在對抗重組牛支原體α化酶時，抗體可在可溶性細胞質(zhì)部分、細胞膜部分以及整個細胞蛋白中檢測到[21]。由此可見，α化酶是一種牛支原體膜相關蛋白，在侵染宿主組織中具有重要作用。該酶分布廣泛，是用于牛支原體檢測的理想蛋白，但目前在蛋白酶方面的研究較少，缺乏相應的檢測方法，可作為今后研發(fā)的重要方向。

5展望

牛支原體嚴重影響了我國乃至全球養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，雖然距離發(fā)現(xiàn)至今已有半個世紀之久，但國內(nèi)外對于牛支原體的研究仍沒有突破性的進展。由于牛支原體沒有細胞壁，其致病性高度依賴細胞質(zhì)膜及其可變表面膜蛋白，它們有利于其形態(tài)性、運動性以及對宿主細胞的黏附性。然而，目前對牛支原體研究仍然有限，張利等[22]通過牛支原體的體外MIC藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)抗生素類藥物幾乎沒有作用，而市場基本沒有商品化疫苗，所以疫苗成為今后研發(fā)的重中之重。同時對牛支原體基因組的測序和ORF的分類仍然是一項艱巨的任務，目前還沒有相匹配的數(shù)據(jù)庫明確ORF的功能，只能通過預測。王艷杰等[23]對牛支原體分離株全基因組進行了序列測定及初步分析，對研究其潛在的致病機制及其調(diào)控機制提供了依據(jù)。因此，要不斷完善牛支原體PG45型、HB0801型和Hubei-1型菌株基因組序列的分析和鑒定。新發(fā)現(xiàn)的免疫原性蛋白越來越多，雖然許多預測膜蛋白還未被認定，其大部分功能也未被證明。但該舉措對增進遺傳特性和發(fā)病機制的理解，開發(fā)行之有效的疫苗，建立靈敏度高、特異性強、快捷方便的檢測技術具有重要意義。

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Progress on Membrane Proteins ofMycoplasmabovis

LI Qiang, ZHAO Ze-hui, NIU Yao-zu ,XU Li-hua

(1.CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750001,China)

Abstract:Membrane proteins are significant structures ofMycoplasmabovis, which play an important role in the interactions with host. In recent years,many reports proved that variable surface lipoproteins may be importantly contributing in the adhesion and pathogenesis ofMycoplasmabovis. In this article, we described some research progress on membrane proteins and variable surface lipoproteins ofMycoplasmabovis. Moreover we gave a further description about diagnostic application of adhesion and membrane proteins. This article will provide a frame of help for membrane proteins research, vaccine and diagnostic kits in the future.

Key words:Mycoplasmabovis; membrane proteins adhesion

收稿日期：2015-12-02

基金項目：國家自然科學基金項目(31560687)；寧夏奶牛育種專項(2013NYYZ0501)

作者簡介：李強(1991-)，男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事預防獸醫(yī)微生物研究。 *通訊作者

中圖分類號:S852.62

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0084-04